1 簡(jiǎn)介
噬菌體展示的出現(xiàn)，對(duì)發(fā)現(xiàn)多肽配體，以及簡(jiǎn)化和優(yōu)化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能十分有效。噬菌體展示篩選有兩個(gè)基本的組成部分：靶標(biāo)大分子和噬菌體。噬菌體是作為一種支架來(lái)展示多肽的重組文庫(kù)的，并且可以用來(lái)釋放和擴(kuò)增結(jié)合在靶標(biāo)大分子上的多肽。通常，靶標(biāo)大分子是蛋白質(zhì)，但也可以是核酸、糖類(lèi)和磷脂，并且可以根據(jù)其純度廣泛地分為簡(jiǎn)單的或復(fù)雜的靶標(biāo)。固定在固相基質(zhì)上的純蛋白（如抗體）是一個(gè)簡(jiǎn)單的靶標(biāo)，而細(xì)胞表面則是一個(gè)復(fù)雜的靶標(biāo)。
2 體內(nèi)及體外的噬菌體展示
本實(shí)驗(yàn)室于1996年報(bào)道了噬菌體展示被成功用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，并描述了與鼠腦或腎的脈管系統(tǒng)特異性結(jié)合的幾段多肽。體內(nèi)噬菌體展示包括靜脈注射噬菌體文庫(kù)，釋放與不同器官和組織的脈管系統(tǒng)結(jié)合的噬菌體，接著擴(kuò)增以及純化，然后重新注射一個(gè)噬菌體文庫(kù)，來(lái)富集能針對(duì)特異性的器官和組織的克隆。體內(nèi)篩選的一個(gè)特征就是可以同時(shí)進(jìn)行正篩選和負(fù)篩選，這是由于器官和組織的脈管系統(tǒng)之間彼此存在著差異，而且在空間上也是分開(kāi)的。當(dāng)特異性噬菌體在靶標(biāo)器官上被富集起來(lái)時(shí)，除靶標(biāo)以外與器官和組織的脈管系統(tǒng)特異性結(jié)合的噬菌體被洗脫下來(lái)。
體外噬菌體展示描述的是將噬菌體溶液添加到器官和組織的原代細(xì)胞懸液中。體內(nèi)和體外噬菌體展示之間的一個(gè)顯著差異是：在體內(nèi)方法中噬菌體首先暴露于血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在體外時(shí)則是暴露于所有類(lèi)型的細(xì)胞。
zui后，我們提到了在培養(yǎng)細(xì)胞上所進(jìn)行的篩選，以及在體內(nèi)噬菌體展示中大分子的粗提和純化。
我們采用體外篩選來(lái)作為預(yù)篩選及篩選的方法，但zui初的用途是測(cè)試從體內(nèi)篩選中發(fā)現(xiàn)的個(gè)別噬菌體。體外噬菌體展示是一種高通量的方法，這使得在一只小鼠上取材，來(lái)篩選許多不同的噬菌體成為可能。我們發(fā)現(xiàn)體外噬菌體展示比體內(nèi)噬菌體展示具有更低的本底，即在體內(nèi)與器官和組織脈管系統(tǒng)結(jié)合的噬菌體，在體外具有更高的親和力，換句話(huà)說(shuō)就是體外的結(jié)合比體內(nèi)定位（homing）具有更高的特異性。體外具有較高的親和力是由于器官和它的脈管系統(tǒng)都表達(dá)受體，定位于肺的GFE—1多肽及其受體——膜二肽酶（membrane dipeptidase）就是一個(gè)例子L14）。然而，體外噬菌體展示也能探測(cè)與少數(shù)細(xì)胞群體結(jié)合的多肽。
3 噬菌體載體
我們所采用的載體是George Smith的源自fd-tet的fUSE5噬菌體載體和Novagen的T7Selecte載體。這兩種噬菌體的大小、形態(tài)和生長(zhǎng)周期都有所不同。fd是一種具有溫和生長(zhǎng)周期的絲狀噬菌體，而T7有一個(gè)二十面體衣殼，并且是一種溶解性噬菌體。具有裂解系統(tǒng)的篩選技術(shù)要更加快速，并且制備有綁定能力的載體也具有商業(yè)可行性。fUSE5以5個(gè)拷貝數(shù)（也就是多價(jià)的）展示作為融合在fd的基因Ⅲ蛋白（pⅢ蛋白）N端的融合蛋白的多肽。Novagen的T7載體展示有1～415個(gè)插入序列的拷貝，相當(dāng)于作為C端與基因10蛋白融合的約1200個(gè)氨基酸。我們利用T7Select415—1b、T7Selectl0—3b和T7Selectt—1b來(lái)作為我們多肽文庫(kù)的載體，并用T7Selectl0—3b和T7Selectl—1b載體來(lái)展示更大的蛋白質(zhì)和cDNA文庫(kù)。