實時定量PCR技術(real-time PCR)也叫qPCR(Quantitave PCR)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法。它是一項臨床上非常成熟的技術，目前在分子生物學領域，qPCR核酸定量好方法。
1、無Ct值出現(xiàn)
a) 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
b) 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。
c) 模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
e) 反應循環(huán)數不夠：一般都要在35個循環(huán)以上，可根據實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。
2、Ct值出現(xiàn)過晚
1、 擴增效率極低：優(yōu)化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計引物。
2、 模板濃度太低：減少稀釋度，重復實驗。
3、 模板降解：重新制備模板，重復實驗。
4、PCR產物太長：一般將PCR產物長度設計為100 bp-200 bp之間。
5、反應體系中存在PCR反應抑制劑：一般為加入模板時帶入，導致模板質量不高，加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實驗。
3、陰性對照出現(xiàn)明顯擴增
1、 反應體系組分(如水)被污染：實驗過程中，更換新的Mix或者水重復實驗。
2、 標本間的交叉污染或產物污染：反應體系在超凈工作臺內配制，對實驗室進行嚴格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭。
3、 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。
4、引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。
5、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高，適當降低引物濃度。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于100 bp以下。
6、擴增效率低
a) 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應條件不佳：適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
c) 反應體系中有抑制物：一般為模板中引入，應先把模板適當稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。
7、實驗重復性差
a) 加樣體積失準：使用性能較好的移液槍，擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準儀器。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒有混勻，請使用前充分混勻。
