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Un1Cas12f1(又名 Cas14a1)是一種內(nèi)切核酸酶，其在 tracrRNA:crRNA(或 sgRNA)的引導(dǎo)下，特異結(jié)合并切割靶標(biāo) ssDNA，且不受 PAM 位點的限制。此外，Un1Cas12f1 也能以 PAM 依賴的方式特異地剪切靶標(biāo)雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。與其他 Cas12 蛋白類似，Un1Cas12f1 蛋白同樣擁有針對ssDNA 的反式切割活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，雙鏈或單鏈 DNA 靶標(biāo)均能激活 Un1Cas12f1 的反式剪切活性，即當(dāng) Un1Cas12f1 蛋白與 sgRNA、靶標(biāo) DNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會被激活針對非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。
相比于其他的 Cas 蛋白，Cas12f1 蛋白的分子量普遍較小(400~700AA)，其中 Un1Cas12f1 的分子量約61.5 kD，可用于靶標(biāo)核酸的分子檢測(詳細(xì)信息請參考 PMID: 30337455)。
產(chǎn)品組成
組分 | 32119-01 (100 pmol) | 32119-03 (1000 pmol) |
Un1Cas12f1 Nuclease (10 μM) a | 100 pmol | 1000 pmol |
10 × HOLMES Buffer 1 | 1 mL | 1 mL |
Control Target ssDNA and sgRNA (10 μM) b | 5 μL | 5 μL |
ssDNA Reporter (FAM-BHQ1, 10 μM) c | 5 μL | 5 μL |
a. Un1Cas12f1 Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；
b. Control Target ssDNA and sgRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個月內(nèi)使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系；
c. ssDNA Reporter (FAM-BHQ1)應(yīng)避光保存，使用時建議取 0.5 μL
保存條件
Control Target ssDNA and sgRNA 于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)切割 1 pmolssDNA 探針?biāo)璧?Cas12f 酶量定義為 1 transU。
例：若某批次 Un1Cas12f1 酶的反式切割活性為 0.7 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 Un1Cas12f1酶可在 1 min 內(nèi)，在上述zhiding的反應(yīng)條件下，反式切割 0.7 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU數(shù)值詳見各批號的 COA 檢測報告。
實驗流程
1. 反式切割實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 µM Un1Cas12f1 Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM sgRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM Target DNAd | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 µM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，Un1Cas12f1 Nuclease 可用 1× HOLMES Buf er 1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長期保存，請使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），crRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋
并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達(dá)平臺期的時間可參考各批號Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見本公司提供的 COA檢測報告。
實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，37℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號。
實驗結(jié)果
注意事項
1. Cas12f 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12f 在 sgRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標(biāo)需帶有 PAM 位點，而 ssDNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 位點。
2. 當(dāng) Un1Cas12f1 結(jié)合靶標(biāo) ssDNA 時，需使用 T7 核酸外切酶對擴增富集生成的靶標(biāo) dsDNA 進(jìn)行處理，且其中一條擴增引物需要采用磷硫?；揎椧源_保 T7 核酸外切酶僅切割其中一條鏈，從而留下ssDNA 靶標(biāo)鏈以用于 Un1Cas12f1 介導(dǎo)的分子檢測。此外，也可以用非對稱 PCR 的方法進(jìn)行擴增，以獲得靶標(biāo) ssDNA(詳細(xì)信息請參考 PMID: 30337455)。
3. Jennifer Doudna 團隊的研究表明，Un1Cas12f1 只能識別和切割 ssDNA 靶標(biāo)(詳細(xì)信息請參考 PMID:30337455)；然而 Virginijus Siksnys 團隊的zuixin研究成果則證明，Un1Cas12f1 同樣具有 PAM 依賴型dsDNA 靶標(biāo)的識別和切割能力，且不同 Cas12f 的 PAM 序列稍有不同，但均富含 T(詳細(xì)信息請參考PMID: 32246713)。
4. Cas12f 的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng) target DNA 存在時，Cas12f/sgRNA 與 target DNA 形成三元復(fù)合物(Cas12f/sgRNA/target DNA)，同時，Cas12f 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)體系中任意序列的單鏈 DNA切碎。
5. 因為防止 RNase 污染，請保持實驗區(qū)干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。
6. Un1Cas12f1 酶對熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
7. 本產(chǎn)品僅供科研使用。
