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AapCas12b 核酸酶(又名 C2c1)是由 tracrRNA:crRNA(或 sgRNA)介導(dǎo)的 DNA 核酸內(nèi)切酶，在靶標(biāo)雙鏈DNA 存在 PAM (TTN) 序列的情況下，特異地剪切靶標(biāo)雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而AapCas12b 特異地剪切單鏈 DNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標(biāo)均能激活 AapCas12b的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當(dāng) AapCas12b 酶與 sgRNA、靶標(biāo) DNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會(huì)被激活針對(duì)非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。
AapCas12b 來源于嗜酸耐熱菌 Alicyclobacillus acidiphilus，zuijia剪切反應(yīng)溫度為 60℃，比 AacCas12b(#32116)更耐高溫。因此，相比于 AacCas12b，AapCas12b 更適用于與 LAMP 聯(lián)用，開發(fā)“一步法"恒溫?cái)U(kuò)增/CRISPR-Cas 檢測(cè)體系(詳細(xì)信息請(qǐng)參考 PMID: 32937062)。
產(chǎn)品組分
組分 | 32118-01(100 pmol) | 32118-03 (1000 pmol) |
AapCas12b Nuclease (10 μM)a | 100 pmol | 1000 pmol |
10 × HOLMES Buffer 1 | 1 mL | 1 mL |
Control Target DNA and sgRNA b | 5 μL | 5 μL |
a. AapCas12b Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；
b. Control Target DNA and sgRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個(gè)月內(nèi)使用，使用時(shí)建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系。
保存條件
Control Target DNA and sgRNA 于-80℃儲(chǔ)存，其余組分-20℃儲(chǔ)存；≤ 0℃運(yùn)輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)剪切 1 pmolssDNA 探針?biāo)璧?Cas12b 酶量定義為 1 transU。
例：若某批次 AapCas12b 酶的反式剪切活性為 6.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 AapCas12b
酶可在 1 min 內(nèi)，在上述zhiding的反應(yīng)條件下，反式剪切 6 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU
數(shù)值詳見各批號(hào)的 COA 檢測(cè)報(bào)告。
實(shí)驗(yàn)流程
1. 順式剪切實(shí)驗(yàn)
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AapCas12b Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
10 μM sgRNA | 0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNAc | 0.5 μL | 25 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
l*若用核酸電泳來分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用 dsDNA靶標(biāo)，因?yàn)?ssDNA靶標(biāo)會(huì)被反式激活的 Cas12b 進(jìn)一步切碎。對(duì)于 20 μL 順式剪切應(yīng)體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長(zhǎng)度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長(zhǎng)度 target DNA需要的 Cas 酶和 sgRNA的量需要根據(jù) target DNA的摩爾量計(jì)算，建議保持 Cas 酶:sgRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 targetDNA被剪切wanquan。
60℃反應(yīng) 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。
2. 反式剪切實(shí)驗(yàn)
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AapCas12b Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 μM sgRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
1 μM Target DNAd | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，用量較少時(shí)可先將各組分稀釋后加入體系，AapCas12b Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長(zhǎng)期保存，請(qǐng)使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），sgRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實(shí)驗(yàn)）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間可參考各批號(hào)Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見本公司提供的 COA檢測(cè)報(bào)告。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀檢測(cè)熒光信號(hào)，60℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號(hào)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注意事項(xiàng)
1. Cas12b 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12b 在 sgRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶
標(biāo)需帶有 PAM 位點(diǎn)，而 ssDNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 位點(diǎn)。
2. Cas12b 的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng) target DNA 存在時(shí)，Cas12b/sgRNA 與 target DNA 形成三元復(fù)合物(Cas12b/sgRNA/target DNA)，同時(shí)，Cas12b 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)體系中任意序列的單鏈 DNA
切碎。
3. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進(jìn)行分子診斷實(shí)驗(yàn)，可參考本公司的 HOLMESv2[1]體系。
4. 為防止 RNase 污染，請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)干凈整潔，操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩，實(shí)驗(yàn)所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。
5. AapCas12b 酶對(duì)熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
6. 本產(chǎn)品僅供科研使用。
