產(chǎn)品簡(jiǎn)介

dsDNA 定量試劑盒是熒光檢測(cè)雙鏈 DNA 并進(jìn)行定量 的一種產(chǎn)品，這種方法非常靈敏。常用于分子生物學(xué)技術(shù)中的：cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建；用于亞克隆的  DNA 片段純化及應(yīng)用，比如進(jìn)行 DNA 定量、產(chǎn)物擴(kuò)增和引物的進(jìn)一步檢測(cè)。 疫苗是現(xiàn)代疾病預(yù)防中常用的控制方式。如今許多疫苗是細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，比如重組乙肝疫苗、狂犬病疫苗等大多數(shù)疫苗都采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)。其中，疫苗的純化是關(guān)鍵問(wèn)題，我們需要盡可能的去除宿主細(xì)胞DNA和宿主蛋白。假若宿主細(xì)胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人體將會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)料的后果。

常規(guī)的DNA含量的檢測(cè)方法是在260nm（A260）處測(cè)其吸光值。這種方法的主要缺點(diǎn)是核苷酸、單鏈核酸和蛋白質(zhì)對(duì)信號(hào)的影響很大，并且還會(huì)受到核酸制備過(guò)程中污染物的干擾，無(wú)法區(qū)分DNA和RNA，而且這種方法不靈敏（5μg/mLdsDNA溶液A260=0.1）。PicoGreen定量檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、方便，被多家生物制品廠所選擇，成為生物制品殘留DNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。

檢測(cè)原理：與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出的熒光，無(wú)DNA不發(fā)熒光；所發(fā)熒光與DNA濃度成正比。Green定量DNA的方法檢出限約0.3ng/ml，DNA含量在1.25-80ng/mL范圍時(shí)線性較好(R2>0.99).

優(yōu)勢(shì)：

1.該方法可以測(cè)定來(lái)源于任何表達(dá)宿主樣品中的雙鏈DNA。

2.可以直接定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物而無(wú)需從反應(yīng)混合物中純化DNA。

3.遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)紫外A260的檢測(cè)方法和Hoechst33258的靈敏度。

4.較高濃度的鹽，尿素，乙醇，氯仿，去垢劑，蛋白或瓊脂糖對(duì)測(cè)定無(wú)影響。

5.在等摩爾濃度 ssDNA 和 RNA 存在的條件下測(cè)定 dsDNA，其影響很小。

實(shí)驗(yàn)步驟

Green dsDNA 定量試劑是以 1mL 的濃縮液形式保存在無(wú)水的 DMSO（二甲基亞砜）中。實(shí) 驗(yàn)當(dāng)天，配制 2XGreen 試劑的操作溶液，用 1xTE 按 1:200 的比例稀釋濃縮液（10mM Tris-HCl，

1mM EDTA，pH7.5）。如果要準(zhǔn)備足夠的操作溶液測(cè)定 20 個(gè)樣品，可在 20mL1x TE 中加入 100μL Green dsDNA 定量試劑。由于試劑容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicoGreen 試劑 見(jiàn)光易降解，所以應(yīng)將配好的溶液用箔包住或放置暗處避光保存。

溶液最好在配制好數(shù)小時(shí)內(nèi)使用，以保證最佳結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)方法：

1). 標(biāo)準(zhǔn)品工作液的配制：

 Sigma小牛胸腺嘧啶DNA干粉（貨號(hào)：D4522-1MG）1mg（Tris，Nacl等濃度已成標(biāo)準(zhǔn)體系），加入1mL雙蒸水，配制成1mg∕mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液；

2). 染料工作液的配置：

6 uLGreen加入1mL TE(注意：用1×TE將FBKGreen稀釋200倍，現(xiàn)用現(xiàn)配，注意避光)。

3). 標(biāo)準(zhǔn)品工作液稀釋：

（1）母液稀釋：取10ul（1mg∕mL）標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到990ul TE溶液中，濃度稀釋成10ug∕mL，取10ul（10ug∕mL）標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到990ul TE溶液中，濃度稀釋成100ng∕mL；

（2）倍比稀釋：取800ul （100ng∕mL）的標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到200ul TE溶液中，濃度達(dá)到80ng∕mL（藥典規(guī)定：熒光染色方法DNA含量在1.25-80 ng/mL范圍線性較好， 該法DNA檢出限為0.3 ng/ml），取500ul（80ng∕mL）的標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到500ul TE溶液中，濃度稀釋到40ng∕mL；依次倍比稀釋，配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

4).標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：倍比稀釋后的各梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液和染料工作液各取100ul混勻，避光室溫放置5min。使用便攜式熒光儀檢測(cè)樣品的熒光值：將混合后的溶液加入微量比色皿，確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測(cè)皿的外部，可以驅(qū)散氣泡。以1×TE緩沖液為blank，測(cè)定樣品和空白對(duì)照的熒光值；用標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（ng/ml）對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度作直線回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5). 測(cè)量剩余樣品的熒光值。熒光計(jì)將給出一個(gè)直接的濃度讀數(shù)，數(shù)據(jù)可以用來(lái)產(chǎn)生DNA 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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