品簡(jiǎn)介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

筆環(huán)肽-AF594標(biāo)記探針會(huì)選擇性地結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白,一般在納摩爾濃度下使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是非常方便的熒光探針，用于標(biāo)記、鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)物或無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。肌動(dòng)蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有真核細(xì)胞中。 它也是最高度保守的蛋白質(zhì)之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過20％。肌動(dòng)蛋白參與許多重要的細(xì)胞過程，包括肌肉收縮、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂、囊泡和細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，以及細(xì)胞連接和細(xì)胞形狀的建立和維持。

鬼筆環(huán)肽比肌動(dòng)蛋白單體更緊密地結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白亞基從絲狀末端解離的速率常數(shù)降低，基本上通過防止絲解聚來穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲。此外，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽抑制F-肌動(dòng)蛋白的ATP水解活性。鬼筆環(huán)肽在細(xì)胞中以不同濃度起作用不同。當(dāng)以低濃度引入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，鬼筆環(huán)肽將較少聚合形式的細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白以及微絲蛋白聚集成聚集的肌動(dòng)蛋白聚合物的穩(wěn)定“島"，但它不會(huì)干擾應(yīng)力纖維，即厚的微絲束。鬼筆環(huán)肽的性質(zhì)是通過用熒光類似物標(biāo)記鬼筆環(huán)肽并用它們?nèi)旧?dòng)蛋白絲用于光學(xué)顯微鏡來研究F-肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞中的分布的有用工具。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已經(jīng)證明在定位活細(xì)胞或固定細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲以及在體外可視化單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲方面非常有用。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作高分辨率肌動(dòng)蛋白研究中的重要工具。

本品以1000×儲(chǔ)存液形式（溶于DMSO）提供，按照100µl/孔（96孔板），總共可做300T。

注意事項(xiàng)：   

鬼筆環(huán)肽  的分子量小，很容易通過細(xì)胞，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

有幾種方法都能用來染色組織細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細(xì)胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實(shí)驗(yàn)自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

操作步驟

1.制備1X鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液：加入1μL1000X鬼筆環(huán)肽綴合物DMSO溶液至1 mL含1％BSA的PBS。

注意1：鬼筆環(huán)肽綴合物的未使用的1000X DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)等分并儲(chǔ)存在-20℃，避光。

注意2：不同的細(xì)胞類型可能染色不同。 應(yīng)相應(yīng)地制備鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液的濃度。

2.染色細(xì)胞：

2.1執(zhí)行甲醛固定。 在室溫下將含3.0-4.0％甲醛的細(xì)胞在PBS中孵育10-30分鐘。

注意：避免使用任何含甲醇的固定劑，因?yàn)榧状紩?huì)在固定過程中破壞肌動(dòng)蛋白。 優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

2.2用PBS沖洗固定的細(xì)胞2-3次。

2.3可選：在PBS中加入0.1％Triton X-100固定細(xì)胞3至5分鐘，以增加滲透性。 用PBS沖洗細(xì)胞2-3次。

2.4將100μL/孔（96孔板）鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液加入固定的細(xì)胞，并在室溫下染色細(xì)胞20至90分鐘。

2.5在加上蓋玻片之前，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2至3次以除去過量的鬼筆環(huán)肽綴合物，然后在顯微鏡下進(jìn)行，密封和成像。

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