產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

鬼筆環(huán)肽-AF 488標(biāo)記探針會(huì)選擇性地結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白,一般在納摩爾濃度下使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是非常方便的熒光探針，用于標(biāo)記、鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。肌動(dòng)蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有真核細(xì)胞中。 它也是最高度保守的蛋白質(zhì)之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過20％。肌動(dòng)蛋白參與許多重要的細(xì)胞過程，包括肌肉收縮、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂、囊泡和細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，以及細(xì)胞連接和細(xì)胞形狀的建立和維持。

鬼筆環(huán)肽比肌動(dòng)蛋白單體更緊密地結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白亞基從絲狀末端解離的速率常數(shù)降低，基本上通過防止絲解聚來穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲。此外，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽抑制F-肌動(dòng)蛋白的ATP水解活性。鬼筆環(huán)肽在細(xì)胞中以不同濃度起作用不同。當(dāng)以低濃度引入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，鬼筆環(huán)肽將較少聚合形式的細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白以及微絲蛋白聚集成聚集的肌動(dòng)蛋白聚合物的穩(wěn)定“島"，但它不會(huì)干擾應(yīng)力纖維，即厚的微絲束。鬼筆環(huán)肽的性質(zhì)是通過用熒光類似物標(biāo)記鬼筆環(huán)肽并用它們?nèi)旧?dòng)蛋白絲用于光學(xué)顯微鏡來研究F-肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞中的分布的有用工具。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已經(jīng)證明在定位活細(xì)胞或固定細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲以及在體外可視化單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲方面非常有用。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作高分辨率肌動(dòng)蛋白研究中的重要工具。

本品以1000×儲(chǔ)存液形式（溶于DMSO）提供，按照100µl/孔（96孔板），總共可做300T。

注意事項(xiàng)：   

鬼筆環(huán)肽  的分子量小，很容易通過細(xì)胞，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

有幾種方法都能用來染色組織細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細(xì)胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實(shí)驗(yàn)自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

自備實(shí)驗(yàn)材料

1.1 TRITC-鬼筆環(huán)肽（貨號(hào)LX4530）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（貨號(hào) SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑

1.6 （可選）即用型PI染色液（貨號(hào) 4209）

1.7 （可選）BSA, Standard Grade（貨號(hào) J8660）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

二、染色工作液準(zhǔn)備

2.1 于實(shí)驗(yàn)前將低溫保存的iFluor 488 Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開瓶。第一次使用請(qǐng)將本品按照單次用量進(jìn)行分裝，置于-20℃避光保存，一年穩(wěn)定。

2.2 本品以1000×DMSO儲(chǔ)存液形式提供。開始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如1µl儲(chǔ)存液加入1ml PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測(cè)體系，按照100µl/孔來計(jì)算，準(zhǔn)備足量的染色工作液；也可對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行染色，但需調(diào)整染色工作液的用量，以能覆蓋住細(xì)胞為準(zhǔn)。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時(shí)間取決于特定的應(yīng)用。根據(jù)特定的細(xì)胞類型和/或細(xì)胞/組織對(duì)探針的通透性來調(diào)整合適的染色條件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲(chǔ)存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

三、染色流程（以96孔板為例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使其貼壁生長(zhǎng)達(dá)到70-80%的匯合度。

3.2 吸掉培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫固定10-30min。【注意】：固定過程中甲醇能破壞肌動(dòng)蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細(xì)胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現(xiàn)配的iFluor 488 Phalloidin染色工作液到每個(gè)孔內(nèi)，室溫避光孵育30-90min。

【注意】：若有需要，此時(shí)可加入即用型PI染色液或其他不同于iFluor 488熒光光譜的細(xì)胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-GTM）到孔內(nèi)保護(hù)熒光。

3.10 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選擇iFluor 488激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=492/518nm）。若做細(xì)胞核染色，選擇合適濾片，比如DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

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