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探針法熒光定量PCR試劑盒它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)小反芻獸疫病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

成分	編號(hào)	十孔盒包裝
探針法 qRT-PCR 緩沖液	A	500μL（黃蓋）
探針法 qRT-PCR 酶混合液	B	100μL（紅蓋）
熒光 PCR 模板稀釋液	C	1 mL（黃蓋）
探針法 qRT-PCR引物混合液	D	100 μL（白蓋）
小反芻獸疫病毒 qRT-PCR 探針	E	50 μL（棕色管）
探針法 qRT-PCR陽性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL)	F	50 μL（黃蓋）
核酸釋釋劑（試用裝）	G	20 次（1mL，綠蓋）
使用手冊(cè)	H	一份

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。

探針法熒光定量PCR試劑盒自備試劑：樣品 RNA。

使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL陽性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免RNA提取的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板，省略了RNA提取步驟。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR 管，其中N+2個(gè)用于上步得到的 N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4 個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用第4號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）：

成分	樣品管N+2個(gè)	RT-PCR陰性對(duì)照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管（2-7 管）
探針法qPCR緩沖液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探針法 qPCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
qRT-PCR探針	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
探針qRT-PCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待測(cè)樣品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超純水	--	5 μL	--
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號(hào)）	--	--	各5 μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3 號(hào)管…）

蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：

過程	溫度	時(shí)間
逆轉(zhuǎn)錄	50℃	30 min
預(yù)變性	94℃	10 min
qRT-PCR 反應(yīng)（40 個(gè)循環(huán)）	94℃	15 sec
qRT-PCR 反應(yīng)（40 個(gè)循環(huán)）	60℃	1 min（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)）

五、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。

六、常見問題與解決方法:

常見問題	可能原因	解決方法
陽性對(duì)照、待測(cè)樣本均無條帶。	PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。	使用梯度PCR摸索PCR反應(yīng)條件。
	PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。	2× PCR Mix應(yīng)保存于-20℃，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在4℃短時(shí)間存放。
	引物設(shè)計(jì)問題。	嘗試重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢查。
陽性對(duì)照有目的條帶，待測(cè)樣本無條帶或條帶弱。	不當(dāng)儲(chǔ)存或長(zhǎng)期儲(chǔ)存引起試劑活性喪失。	使用新鮮的試劑。
	加入組織裂解液過量。	增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。
	樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時(shí)間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。
	模板加入量不適合。	在反應(yīng)體系10-20%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。反應(yīng)效性能較差時(shí)，可以降模板濃度調(diào)節(jié)到低于10%的范圍。
	PCR循環(huán)數(shù)不足。	適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因?yàn)槟０鍙?fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的 DNA模板多5-10個(gè)循環(huán)為佳。
非特異性擴(kuò)增	PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。	增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。
	PCR引物錯(cuò)配。	重新設(shè)計(jì)PCR引物。
	配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久。	PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
陰性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶	操作工具或試劑污染。	實(shí)驗(yàn)所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。
陰性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶	樣本間交叉污染。	每個(gè)取樣器只對(duì)一個(gè)樣本使用；或取完一個(gè)樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。