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PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南之污染與對策

2012年02月02日 08:41:32人氣:1399來源:上海滬宇生物科技有限公司

PCR 反應(yīng)的zui大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與*的靈敏性,但令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。

1、污染原因

(1)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時,由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。

(2)PCR 試劑的污染:主要是由于在PCR 試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染。

(3)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染。這是PCR 反應(yīng)中zui主要zui常見的污染問題。因?yàn)镻CR 產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013 拷貝/ml),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限,所以極微量的PCR 產(chǎn)物污染,就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視,zui可能造成PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個氣溶膠顆??珊?8000 拷貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

(4)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室,這個問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。

2、污染的監(jiān)測

一個好的實(shí)驗(yàn)室,要時刻注意污染的監(jiān)測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

對照試驗(yàn):

(1)陽性對照:在建立PCR 反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR 陽性對照,它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志。陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100 個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時,在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對照。

(2)陰性對照:每次PCR 實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照。它包括①標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。②試劑對照:在PCR 試劑中不加模板DNA 或RNA,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,以監(jiān)測試劑是否污染。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)

(4)選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增

3、防止污染的方法

(1)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR 反應(yīng)液、PCR 循環(huán)擴(kuò)增及PCR 產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR 產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR 反應(yīng)液制備區(qū);③PCR 循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR 產(chǎn)物鑒定區(qū)。 其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA 或RNA。

(2)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心,吸樣要慢,吸樣時盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

(3)預(yù)混和分裝PCR 試劑:所有的PCR 試劑都應(yīng)小量分裝,如有可能,PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好,然后小量分裝,-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù),避免污染機(jī)會。另外,PCR 試劑,PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR 產(chǎn)物分開保存,不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

(4)防止操作人員污染,使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。

(5)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?,陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的zui低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜,并注意交叉污染的可能性,每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。

(6)減少PCR 循環(huán)次數(shù),只要PCR 產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。

(7)選擇質(zhì)量好的Eppendorf 管,以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入,打開離心管前應(yīng)先離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕,以防管內(nèi)液體濺出。

4、PCR 污染解決對策

PCR 檢測微量感染因子時,一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題。

(1)污染的預(yù)防:進(jìn)行PCR 操作時,操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程,zui大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

(2)劃分操作區(qū):目前,普通PCR 尚不能做到單人單管,實(shí)現(xiàn)*閉管操作,但無論是否能夠達(dá)到單人單管,均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行:

a、標(biāo)本處理區(qū),包括擴(kuò)增摸板的制備;

b、PCR 擴(kuò)增區(qū),包括反應(yīng)液的配制和PCR 擴(kuò)增;

c、產(chǎn)物分析區(qū),凝膠電泳分析,產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

各工作區(qū)要有一定的隔離,操作器材,要有一定的方向性。如:標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物分析,產(chǎn)物處理。

切記:產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

(3)分裝試劑:PCR 擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA 和其他來源的DNA:

a、PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水;

b、引物和dNTP 用高壓的雙蒸水在無PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制;

c、引物和dNTP 應(yīng)分裝儲存,分裝時應(yīng)標(biāo)明時間,以備發(fā)生污染時查找原因。

(三) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真,在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意:

a、戴一次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套;

b、使用一次性吸頭,嚴(yán)禁與PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染;

c、避免反應(yīng)液飛濺,打開反應(yīng)管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

d、操作多份樣品時,制備反應(yīng)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應(yīng)的度;

e、zui后加入反應(yīng)模板,加入后蓋緊反應(yīng)管;

f、操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照,即可驗(yàn)證PCR 反應(yīng)的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性;

g、盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由于加樣器zui容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA 的污染,使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該,不能交叉使用,尤其是PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū);

h、重復(fù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證結(jié)果,慎下結(jié)論。

5、追蹤污染源

如果不慎發(fā)生污染情況,應(yīng)從下面幾條出發(fā),逐一分析,排除污染。

(1)設(shè)立陰陽性對照:有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時,應(yīng)選擇擴(kuò)增弱,且重復(fù)性好的樣品,因強(qiáng)陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列,反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照,100 個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴(kuò)增。陰性對照的選擇亦要慎重,因?yàn)镻CR 敏感性*,可以從其它方法(Sourthern 印跡或點(diǎn)雜交等)檢測陰性的標(biāo)本中檢測出極微量的靶分子。此外,每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR 體系中各試劑的時機(jī)對照,即包括PCR 反應(yīng)所需的全部成分,而不加模板DNA,這對監(jiān)測試劑中PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果,就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時,要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增時設(shè)立不同的反應(yīng)管,每一管含有一種被檢測試劑,在檢出污染試劑后,應(yīng)馬上處理。

(2)環(huán)境污染:在排除試劑污染的可能性外,更換試劑后,若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了,如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密,則考慮可能為環(huán)境污染。

環(huán)境污染中常見的污染源主要有:

a、模板提取時真空抽干裝置;

b、凝膠電泳加樣器;

c、電泳裝置;

d、紫外分析儀;

e、切膠用刀或*片;

f、離心機(jī);

g、冰箱門把手,冷凍架,門把手或?qū)嶒?yàn)臺面等;此時可用擦拭實(shí)驗(yàn)來查找可疑污染源。1)用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源;2)0。1ml 去離子水浸泡;3)取5ml 做PCR 實(shí)驗(yàn);4)電泳檢測結(jié)果。

h、氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn),仍不能查找到確切污染源,則污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的,此時就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場所,若條件不允許,則重新設(shè)計(jì)新的引物(與原引物無相關(guān)性)。

6、污染處理

(1)環(huán)境污染

a、稀酸處理法:對可疑器具用1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡,使殘余DNA 脫嘌呤;

b、紫外照射(UV)法:紫外波長(nm)一般選擇254/300nm,照射30min 即可。需要注意的是,選擇UV 作為消除殘留PCR 產(chǎn)物污染時,要考慮PCR 產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布,UV 照射僅對500bp 以上長片段有效,對短片段效果不大。UV 照射時,PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體,這些二聚體可使延伸終止,但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體,且UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV 波長,嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA 鏈上,形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0。065/堿基,其他非二聚體的光照損傷(如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體,胸腺嘧啶乙二醇,DNA 鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA 斷裂等)均可終止Taq DNA 聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)( 0。13/堿基)在DNA 分子上隨機(jī)分布,一個500bp片段的DNA 分子鏈上將有32 處損傷位點(diǎn),那么,105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反,如果100bp 的片段,每條鏈上僅有6 處損傷,105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV 照射有一定的片段長度限制的原因。

(2)反應(yīng)液污染

可采用下列方法之一處理:

a、DNase I 法:PCR 混合液(未加模板和Taq 聚合酶)加入0。5U DNase I,室溫反應(yīng)30min 后加熱滅活,然后加入模板和Taq 聚合酶進(jìn)行正常PCR 擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA 的序列;

b、內(nèi)切酶法:選擇識別4 個堿基的內(nèi)切酶(如Msp I 和Taq I 等),可同時選擇幾種,以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷,室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR;

c、紫外照射法:未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液進(jìn)行紫外照射,注意事項(xiàng)與方法同上述UV 照射法;

d、g 射線輻射法:1。5kGy 的輻射可*破壞0。1ng 基因組DNA,2。0 kGy 可破壞104 拷貝的質(zhì)粒分子,4。0 kGy 仍不影響PCR,但高于此限度會使PCR 擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g 射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA 的。

e、*糖苷酶(UNG)法:由于UV 照射的去污染作用對500bp 以下的片段效果不好,而臨床用于檢測的PCR 擴(kuò)增片段通常為300bp 左右,因此UNG 的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。原理:在PCR 產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育,因UDG 可裂解*堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵,可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸,從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響。UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除*,而對RNA 中的*和單一*分子則無任何作用。

f、dUTP 法:用dUTP 代替dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR 擴(kuò)增前,用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活,因此不會影響含dU 的新的PCR 產(chǎn)物。

g、dU 引物法:合成引物時以dU 代dT,這樣PCR 產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU。UNG 處理后,引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對長片段(1-2kb 以上)的擴(kuò)增用dUTP 法效率較用dTTP低,而用dU 法就可克服這一缺點(diǎn)。dU 引物將dU 設(shè)計(jì)在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。優(yōu)點(diǎn):可以去除任何來源的污染;UNG 處理可以和PCR 擴(kuò)增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行;由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU 存在,可*消除污染源。需注意的是摻入dUTP 的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響,在進(jìn)行PCR 產(chǎn)物克隆時,應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-(UNG 缺陷)大腸桿菌受體菌,否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG 消化掉。

h、固相捕獲法:用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì),原理如下:1)用一*標(biāo)記的單鏈RNA 探針與待擴(kuò)核酸雜交,雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū);2)用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有*探針的雜交核酸,通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì);3)洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA 探針雜交區(qū)域。第2)步的漂洗后可用PCR 檢測以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。

i、RS-PCR 法(RNA-specific PCR):也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA 模板的特異性PCR 法,該法可明顯降低假陽性而不影響PCR 的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物,逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端(A 區(qū))有2 0 個核苷酸左右為模板的特異性互不序列,5ˊ端2 0 個核苷酸(C 區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后,經(jīng)超速離心使cDNA 與多余引物分開,再用和第二引物(C)以*鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR 循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B 區(qū)和引物C 進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA,而污染的DNA 或質(zhì)粒DNA 才不會被擴(kuò)增。

j、抗污染引物法:該對引物擴(kuò)增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn)。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中,在重組質(zhì)粒中,這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本,也不能擴(kuò)增出任何條帶,即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶,其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物擴(kuò)增,因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的,該法試用于環(huán)狀靶分子系列。

附錄: 各種堿基符號

在設(shè)計(jì)簡并引物或測序時你可能會碰到這樣的符號來表示堿基,到時候不要不知道哦:

B = C or G or T

D = A or G or T

H = A or C or T

K = G or T

M = A or C

N = A or C or G or T

R = A or G

S = C or G

V = A or C or G

W = A or T

Y = C or T

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