1、感受態(tài)細(xì)胞的概念 
重組 DNA 分子體外構(gòu)建完成后,必須導(dǎo)入特定的宿主(受體)細(xì)胞,使之無性繁殖并表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀,這個(gè)導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化.在原核生物中,轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象,在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生,一方面取決于供體菌與受體菌兩者在 進(jìn)化 過程中的親緣關(guān)系,另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系. 
   所謂的感受態(tài),即指受體(或者宿主)zui易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài),它是由受體菌的遺傳性狀所決定的,同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響.cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍,而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用.細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生*,新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵. 
制備出的 感受態(tài)細(xì)胞 暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15%的無菌 甘油 或-70℃保存(有效期6個(gè)月). 

2、轉(zhuǎn)化的概念及原理 
    在基因克隆技術(shù)中,轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入 細(xì)菌 體內(nèi),使之獲得新的遺傳特性的一種方法.它是 微生物 遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一. 
   受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如：電擊法,CaCl2等化學(xué)試劑法)處理后,使 細(xì)胞膜 的通透性發(fā)生變化,成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞.進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀. 
   大腸桿菌 的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法( CaCl ₂ 法),該法zui先是由Cohen于1972年發(fā)現(xiàn)的.其原理是細(xì)菌處于0℃,CaCl2的低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理,促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物,在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時(shí)后,球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值,被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中,重組子中基因得到表達(dá),在選擇性培養(yǎng)基平板上,可選出所需的轉(zhuǎn)化子. 
    Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞,其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到5×106~2×107轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA,可以滿足一般的基因克隆試驗(yàn).如在Ca2+的基礎(chǔ)上,聯(lián)合其它的二價(jià)金屬離子(如Mn2+、Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,則可使轉(zhuǎn)化率提高100~1000倍.化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好,菌株適用范圍廣,感受態(tài)細(xì)菌可以在-70℃保存,因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化.除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外,還有電擊轉(zhuǎn)化法,電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài),依靠短暫的電擊,促使DNA進(jìn)入細(xì)菌,轉(zhuǎn)化率zui高能達(dá)到109~1010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA.因操作簡便,愈來愈為人們所接受. 

3、感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素 
⑴、細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液.不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接,及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液. 細(xì)胞生長 密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳.即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌,可通過測(cè)定培養(yǎng)液的OD600控制.對(duì)TG1菌株,OD600為0．5時(shí),細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右.(應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同).密度過高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降. 
   此外,受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的 突變 株,即不含限制性內(nèi)切酶和 甲基化 酶的突變株.并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配. 
⑵、 質(zhì)粒 DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的,轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降.一般地,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和.對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言,分子量大的轉(zhuǎn)化效率低,實(shí)驗(yàn)證明,大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化.此外,重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān),環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍,因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子. 
⑶、試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是zui高純度的,并用zui純凈的水配制,分裝保存于4℃. 
⑷、防止雜菌和雜DNA的污染 
   整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管, 移液槍頭 等是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理.所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入. 
⑸、整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行,不能離開冰浴,否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低.