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上海金穗生物科技有限公司

Silica gel吸附法分離與純化DNA片段

時(shí)間:2013-1-17閱讀:489
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方法步驟:
1) 經(jīng)BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31,置于65℃水浴10 min,移
至冰浴降溫后,以含EtBr 的1.0% agarose gel 進(jìn)行電泳 (兩種樣品各用六個(gè)wells,每個(gè)well 注入30 μL 樣品)。
2) 電泳后以長(zhǎng)波長(zhǎng)UV 燈觀察DNA 片段所在位置,并以干凈刀片將GUS 及pQE31 片段切下,請(qǐng)盡可能去除周圍多余的膠體。
3) 取數(shù)個(gè)微量離心管,分別稱重并記錄重量后,將膠體置于管中再稱重,估計(jì)膠體重量。
◆ 注意! 每管膠體不可超過400 mg。
4) 于離心管中加入Buffer QG,加入比例為: 每100 mg 膠體加入0.4 mL BufferQG。
◆ Buffer QG 中含有g(shù)uanidine hydrochloride,會(huì)對(duì)皮膚及眼睛造成傷害,請(qǐng)小心使用。
5) 置50℃水浴中15 min,每隔 2~3 min 以手指輕彈管壁促進(jìn)膠體溶解。如果膠體尚未溶解*,則延長(zhǎng)5~10 min,務(wù)使膠體*溶解。
6) 待膠體*溶解后,檢查溶液顏色是否為黃色 (應(yīng)與Buffer QG 相近),若顏色為橘色或紫色,表示pH 值不恰當(dāng),請(qǐng)加入10 μL NaOAc (3 M, pH 5.0),混合均勻后,再檢查溶液的顏色。
◆ 膠體溶液的pH 值必須≦7.5,若大于7.5,會(huì)造成DNA 與silica-gelmembrane 間的吸附效率驟降。此組套的Buffer QG 中含有pH 指示劑,若pH≦7.5,溶液顏色應(yīng)呈黃色。
7) 將spin column 置于2 mL 收集管中,加入上述*溶解的膠體溶液,以12,000rpm 離心1 min。
◆ 每個(gè)QIAquick spin column 只能裝約0.8 mL 溶液,所以請(qǐng)分多次離心,每次離心完需將下方收集管內(nèi)的收集液倒掉。
◆ 若 DNA 片段小于500 bp 或大于4 kb,可于膠體溶液中加入1 倍體積的isopropanol,混合均勻后,再加入spin column 中離心,以提高DNA 回收效率。
8) 將spin column 置回收集管上,加入0.5 mL Buffer QG,再以12,000 rpm 離心1 min,以去除殘存的agarose 膠體。
9) 離心后,倒掉收集管中的溶液。將spin column 置回收集管上,在spin column中加入0.75 mL Buffer PE,于室溫靜置2~5 min 后,以12,000 rpm 離心1 min,并去除收集管中的溶液。
10) 將spin column 置回收集管中,再于13,000 rpm 離心1 min,以*去除spincolumn 中殘留的Buffer PE
◆ Buffer PE 中含有酒精,必須*去除,否則易干擾后續(xù)酶反應(yīng)。
11) 將spin column 置于干凈的1.5 mL 微量離心管中。將30 μL 溶離緩沖液(Buffer EB) 加在silica membrane 上,靜置1~5 min,以將吸附于膜上的DNA*溶離出。
◆ 溶離緩沖液的pH 值需在7.0~8.5 間,才能達(dá)到*溶離效果。也可以用TE-8.0 或水作為溶離液,但使用TE-8.0 時(shí),需考慮EDTA 是否對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有影響;使用水進(jìn)行溶離時(shí),則需注意水的pH 值,及溶離DNA 的保存 (DNA 在水中并不不穩(wěn)定)。
12) 以12,000 rpm 離心2 min。收集微量離心管中含有DNA 的溶離液,并進(jìn)行DNA 的定量及接合反應(yīng)。

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