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上海金穗生物科技有限公司

噬菌體展示文庫活體篩選的通用步驟

時間:2012-12-19閱讀:565
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1.通過腹腔注射濃度為1.25%(w/v)的阿佛丁來麻醉小鼠,劑量為每克體重注射15ul的阿佛丁。開始時用*注射300ul。用右手抓住一只小鼠尾部的并提起,使其后腿離地。然后用左手抓住鼠的頭和頸的后部,提起并翻轉(zhuǎn)小鼠,暴露其腹部。將其固定,盡可能使小鼠不要扭曲或翻身。用右手注射300ul麻醉劑,其將在1分鐘內(nèi)起效。如果小鼠還未被麻醉,那就再注射100ul增量的麻醉劑,直到小鼠表現(xiàn)出深度麻醉的跡象。麻醉時間應(yīng)該持續(xù)30~60分鐘。
2.將鼠尾置于溫水中,使其尾部血管擴張。
3.用*向一根鼠尾血管注射200~500ul噬菌體懸液。所選鼠尾血管在尾部一側(cè),并與皮膚表層非常接近。將針頭成斜角插入尾部血管,接著以正壓推動注射器活塞,從而注射約20f11的噬菌體懸液。假如血管暫時沒有紅色血液和填充物,那就要正確地確定血管的位置。通過每次注射20/A1懸液并在每次注射后使血管再填滿的方式,緩慢注射剩余噬菌體。
4.讓噬菌體zui少循環(huán)5分鐘。
5.將小鼠背部朝下,直接用剪刀在胸腔下的腹部剪開一個口,可以看到肝臟的下側(cè)。用剪刀的將肝臟移到旁邊,同時暴露橫隔膜。刺破隔膜并把胸腔的一側(cè)剪碎,然后橫過隔膜把相對一側(cè)的胸腔也剪碎。用*夾緊劍狀軟骨,并打開胸腔暴露整個心臟。剪開心臟和胸骨之間的所有連接組織??紤]到排水,zui后要在胸腔的一側(cè)沿腹背方向切開一個口。當(dāng)正確進(jìn)行以上步驟時,所有的程序都應(yīng)該相對無血。皮膚將會少量地出血,但不應(yīng)有血液在胸腔內(nèi)積聚,也不能有任何來自心臟或其他主血管的大出血。
6,用10ml的DMEM或PBS來灌注小鼠。首先將注射器針頭插入左心室3—5mm,然后推動活塞。若針頭位置已經(jīng)正確,那么你將看到心臟左側(cè)會失色并輕微膨脹。接著用左手拿剪刀剪開右心房,開始用DMEM或PBS勻速灌注,以保持心臟膨脹并仍然跳動的速率,大約2ml/min。

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