木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Linin peroxidase ，Lip）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.14）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，屬于木質(zhì)素降解酶系，在木質(zhì)素生物降解、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、芳香化合物轉(zhuǎn)化與降解及環(huán)境污染控制等方面具有較大的應(yīng)用潛力。

測(cè)定原理

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶氧化藜蘆醇生成藜蘆醛，在 310nm 處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）。

試劑組成和配制

試劑一：液體 115mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 4mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體 2mL×1 支，4℃保存。

酶液提取

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后 4℃，10000g 離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作

酶活計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 215×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（nmol/min/g）=△A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 215×△A÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（nmol/min/10⁴cell）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 215×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（nmol/min/L）=△A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 2.15×10⁵×△A

ε：藜蘆醛摩爾消光系數(shù)：9300L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；

V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

LiP 活性（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 430×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

LiP 活性（U/g）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T= 430×△A÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

LiP 活性（U/10⁴cell）=△A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 430×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

LiP 活性（U/L）=△A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 4.3×10⁵×△A

ε：藜蘆醛摩爾消光系數(shù)：9300L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，

1mL；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃

度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min