酶底物法檢測(cè)系統(tǒng)適用于地表水,地下水,生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群,糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定.本方法的檢出限為10MPN/L.
水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定酶底物法
1、適用范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定。本方法的檢出限為10MPN/L。 2、規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法 GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫(kù)采樣技術(shù)指導(dǎo) HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo) HJ/T91地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范 3、術(shù)語(yǔ)和定義 下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3.1 總大腸菌群totalcoliforms 37℃培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基的腸桿菌科細(xì)菌。 3.2 糞大腸菌群fecalcoliforms又稱(chēng)耐熱大腸菌群（thermotolerantcoliforms）。44.5℃培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基的腸桿菌科細(xì)菌。 3.3 大腸埃希氏菌Escherichiacoli俗稱(chēng)大腸桿菌。37℃培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基，同時(shí)產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）釋放出熒光物質(zhì)（4-甲基傘形酮）的腸桿菌科細(xì)菌。 3.4 可能數(shù)mostprobablenumber（MPN）又稱(chēng)稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)，是一種基于泊松分布的間接計(jì)數(shù)法。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽(yáng)性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在的數(shù)量（單位體積存在目標(biāo)微生物的可能數(shù)）。 4、方法原理 在特定溫度下培養(yǎng)特定的時(shí)間，總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，將選擇性培養(yǎng)基中的無(wú)色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為黃色的鄰硝基（ONP）；大腸埃希氏菌同時(shí)又能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，將選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解為4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，查MPN表，分別計(jì)算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。 5、干擾和消除 5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集（8.1）時(shí)加入溶液（6.4）消除干擾。 5.2重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集（8.1）時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.5）消除干擾。 6、試劑和材料 除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水應(yīng)滿(mǎn)足GB/T6682中三級(jí)水的要求。 6.1培養(yǎng)基。 本標(biāo)準(zhǔn)采用MinimalMediumONPG-MUG培養(yǎng)基。每100ml樣品需使用培養(yǎng)基粉末。 2.7g±0.5g，所含基本成分如下： 硫酸銨[(NH4)2SO4]0.5g 硫酸錳（MnSO4）0.05mg 硫酸鋅（ZnSO4）0.05mg （MgSO4）10mg 氯化鈉（NaCl）1g 氯化鈣（CaCl2）5mg 亞硫酸鈉（Na2SO3）4mg （AmphotericinB）0.1mg 鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）50mg 4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）7.5mg 茄屬植物萃取物（Solanium萃取物）50mg N-2--N-2-乙磺酸鈉鹽（HEPES鈉鹽）0.53g N-2--N-2-乙磺酸（HEPES）0.69g 也可采用市售商品化培養(yǎng)基制品。 6.2（Na2S2O3·5H2O）。 6.3乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）。 6.4溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10g/ml。稱(chēng)取15.7g（6.2），溶于適量水中，定容至100ml，臨用現(xiàn)配。 6.5乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15g/ml。稱(chēng)取15g乙二胺四乙酸二鈉（6.3），溶于適量水中，定容至100ml，此溶液保質(zhì)期為30d。 6.697孔定量盤(pán)：含49個(gè)大孔，48個(gè)小孔。其中，每個(gè)小孔可容納0.186ml樣品，大孔中48個(gè)大孔每個(gè)可容納1.86ml樣品，一個(gè)頂部大孔可容納11ml樣品。也可采用經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品。 6.7標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤(pán)。 6.8無(wú)菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。 7、儀器和設(shè)備 7.1采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的100ml、250ml、500ml廣口玻璃瓶。 注：在采集不存在或不考慮余氧、金屬離子干擾的樣品時(shí)，可采用市售無(wú)菌采樣瓶或無(wú)菌采樣袋。 7.2高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。 7.3恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。 7.4程控定量封口機(jī)：用于97孔定量盤(pán)（6.6）的封口。 7.5紫外燈：365～366nm。 7.6移液管：1ml±0.01ml、10ml±0.1ml。也可采用計(jì)量合格的可調(diào)式移液器。 7.7三角瓶：100ml。 7.8量筒：100ml±1ml。 7.9一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。 注：三角瓶、移液管、采樣瓶等玻璃器皿及采樣器具要在試驗(yàn)前按無(wú)菌操作要求包扎，121℃高壓蒸 汽滅菌20min，烘干，備用。 8、樣品 8.1樣品采集 點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。采集河流、湖庫(kù)等地表水樣品時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒(méi)有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無(wú)菌包裝紙。從龍頭裝置采集樣品時(shí)，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開(kāi)至，放水3～5min，然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌或用70%～75%的酒精對(duì)龍頭進(jìn)行消毒，開(kāi)足龍頭，再放水1min，以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jī)?nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時(shí)，也可使用滅菌過(guò)的專(zhuān)用采樣裝置采樣。在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入溶液（6.4），以除去活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用（每125ml容積加入0.1ml的溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.5），以消除干擾（每125ml容積加入0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。 注：15.7mg（6.2）可去除樣品中1.5mg活性氯，用量可根據(jù)樣品實(shí)際活性氯 量調(diào)整。 8.2樣品保存 采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測(cè)，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過(guò)6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開(kāi)展檢測(cè)的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測(cè)。 9、分析步驟 9.1樣品稀釋 根據(jù)樣品污染程度確定接種量（見(jiàn)表1），避免接種樣品培養(yǎng)后97孔定量盤(pán)（6.6）出現(xiàn)全部陽(yáng)性或全部陰性。接種量小于100ml時(shí)，應(yīng)稀釋樣品后接種，接種量為10ml時(shí)，取10ml樣品加入到盛有90ml無(wú)菌水（6.8）的三角瓶（7.7）中混勻制成1:10的稀釋樣品，其他接種量的稀釋樣品依次類(lèi)推。對(duì)于未知樣品，可選用多個(gè)接種量進(jìn)行檢測(cè)。
9.2接種
量取100ml樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶，加入2.7g±0.5g培養(yǎng)基（6.1）粉末，充分混勻，溶解后，全部倒入97孔定量盤(pán)（6.6）內(nèi)，以手撫平97孔定量盤(pán)背面，趕除孔內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機(jī)（7.4封口。觀(guān)察97孔定量盤(pán)顏色，若出現(xiàn)類(lèi)似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤(pán)（6.7）的顏色，則需排查樣品、培養(yǎng)基、無(wú)菌水等一系列因素后，終止試驗(yàn)或重新操作
注：9.1、9.2步驟在野外操作時(shí)應(yīng)避開(kāi)明顯局部污染源，建議使用一次性手套、口罩、酒精燈等。
9.3培養(yǎng)
測(cè)定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時(shí)，將封口后的97孔定量盤(pán)放入恒溫培養(yǎng)箱（7.3）中37℃±1℃下培養(yǎng)24h。測(cè)定糞大腸菌群時(shí)，將封口后的97孔定量盤(pán)放入的恒溫培養(yǎng)箱中44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h。
9.4對(duì)照試驗(yàn)
9.4.1空白對(duì)照
每次試驗(yàn)都要用無(wú)菌水（6.8）按照步驟9.1～9.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定。培養(yǎng)后的97孔定量盤(pán)不得有任何顏色反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。
9.4.2陰性和陽(yáng)性對(duì)照
總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的陰性、陽(yáng)性菌株參考表2。
| 檢測(cè)指標(biāo) | 陽(yáng)性菌種 | 陰性菌種 |
| 總大腸菌群 | 大腸埃希氏菌、
產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes） | （Staphylococcus aureus）、
假單胞菌屬（Pseudomonas sp.） |
大腸埃希氏
菌 | 大腸埃希氏菌 | 、
假單胞菌屬 |
| 糞大腸菌群 | 大腸埃希氏菌（耐熱型）、
克雷伯氏菌屬（Klebsiella trevisan）
（耐熱型） | 產(chǎn)氣腸桿菌、
糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）、
假單胞菌屬 |
將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300～3000個(gè)/ml的菌懸液，將菌懸液按接種（9.2）和培養(yǎng)（9.3）要求操作，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新測(cè)定。
注：可先制備較高濃度菌懸液，采用在顯微鏡下對(duì)其濃度進(jìn)行初步測(cè)定，然后根據(jù)實(shí)際情
況用無(wú)菌水（6.8）稀釋至300～3000個(gè)/ml。
9.4.3結(jié)果判讀與計(jì)數(shù)
將培養(yǎng)24h后的97孔定量盤(pán)進(jìn)行結(jié)果判讀，樣品變黃色判斷為總大腸菌群或糞大腸菌群陽(yáng)性；樣品變黃色且在紫外燈（7.5）照射下有藍(lán)色熒光，判斷為大腸埃希氏菌陽(yáng)性。如果結(jié)果可疑，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至28h進(jìn)行結(jié)果判讀，超過(guò)28h后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽(yáng)性結(jié)果?？墒褂帽Ｙ|(zhì)期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤(pán)以輔助判讀，參見(jiàn)附錄A。分別記錄97孔定量盤(pán)中大孔和小孔的陽(yáng)性孔數(shù)量。
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