超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)Genome Sequencer FLX System的詳細(xì)介紹
超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)強(qiáng)大的羅氏第二代超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)GS FLX，配備全新的GS FLX Titanium系列試劑，加速生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的快速發(fā)展。
GS FLX系統(tǒng)具備專業(yè)的分析工具，涵蓋用于圖譜繪制、序列拼接和擴(kuò)增子變異檢測(cè)等各類簡(jiǎn)單、易操作的圖形用戶界面(GUI)。測(cè)序讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，
■ 平均可達(dá)400-500bp(圖1)；
■ 通量更高，每單次運(yùn)行可獲一百萬(wàn)條高質(zhì)量數(shù)據(jù)；
■ 速度更快，完成一次測(cè)序僅需10小時(shí)；
■ 準(zhǔn)確率更高，單條讀長(zhǎng)超過400bp時(shí)，測(cè)序準(zhǔn)確率仍高于99.6% ；
■ 多倍覆蓋下，準(zhǔn)確率高于99.99%。
靈活的GS FLX系統(tǒng)， 突破更多的應(yīng)用領(lǐng)域
■ 全新基因組測(cè)序和序列拼接
■ 重測(cè)序和圖譜繪制
■ 轉(zhuǎn)錄組分析
■ 表觀遺傳學(xué)變異檢測(cè)
■ 宏基因組學(xué)和微生物多樣性
■ 古生物DNA
■ 病毒基因組測(cè)序
■ HIV 測(cè)序
■ 擴(kuò)增子重測(cè)序
上樣及樣品DN斷化
GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品序列測(cè)定：包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BACs和cDNA等等?；蚪MDNA和BACs等樣品需被打斷至600-900bp的小片斷。對(duì)于像非編碼RNA或PCR擴(kuò)增子等小分子樣品，則不需要這一步。而通過GS融合引物擴(kuò)增得到的短片段PCR產(chǎn)物可以直接將其固定于DNA捕獲磁珠上，如下文“一個(gè)片段=一顆磁珠”中所示。
文庫(kù)的制備
利用分子生物學(xué)技術(shù)，將3'和5'端的特異性接頭(A和B)連接至每
斷即構(gòu)成了工作流程中的DNA文庫(kù)。(其中GS FLX Titanium 系列試劑盒提供的接頭A和B片段不同于GS FLX 標(biāo)準(zhǔn)系列試劑盒提供的)。
一個(gè)片段 = 一顆磁珠
單鏈DNA文庫(kù)被固定于特殊設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。特異接頭使各條DNA 片段分別結(jié)合于各自的磁珠之上。結(jié)合有不同DNA的磁珠文庫(kù)經(jīng)油水混合的擴(kuò)增試劑
乳化分散后，形成成百上千顆微乳滴， 每一微乳滴內(nèi)僅含有一顆磁珠和一條特異的樣品DN段。
emPCR 擴(kuò)增(乳滴PCR)
每一DN段在其各自的微乳滴中進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，排除了其它競(jìng)爭(zhēng)性或污染性序列對(duì)PCR反應(yīng)的影響。所有DN段平行擴(kuò)增，各個(gè)磁珠上的不同DN段均獲得數(shù)
百萬(wàn)個(gè)擴(kuò)增拷貝。隨后，打破微乳滴，得到結(jié)合于各磁珠的特異擴(kuò)增片斷。
一顆磁珠 = 一條讀長(zhǎng)
將所有結(jié)合有DN段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中進(jìn)行測(cè)序。PTP板的孔徑恰好僅能容納一顆磁珠。將PTP板置于GS FLX測(cè)序儀中，單個(gè)核苷酸依次流經(jīng)孔洞
和DNA捕獲磁珠間。當(dāng)所加入的一種或多種核苷酸與模板互補(bǔ)時(shí)，便產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，進(jìn)而被 GS FLX系統(tǒng)的CCD相機(jī)記錄。
數(shù)據(jù)分析
通過信號(hào)強(qiáng)度和PTP板上的位置信息，內(nèi)置軟件能夠在10小時(shí)測(cè)序運(yùn)行的同時(shí)對(duì)1,000,000條數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)于測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，三種不同的生物信息學(xué)分析工具分
別支持以下應(yīng)用：(1)對(duì)高達(dá)400Mb大小的全新基因組拼接；(2)對(duì)高達(dá)3Gb大小的基因組圖譜分析；(3)專用于擴(kuò)增子重測(cè)序的圖形用戶界面。
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