脂多糖( LPS )，也稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。LPS是脊椎動物先天免疫系統(tǒng)的強力刺激劑，可引起發(fā)燒、感染性休克、死亡。它也被認為是檢測細菌病原體入侵的生物標志物，負責炎癥反應和內(nèi)毒素休克的發(fā)展。在生物材料，如蛋白質(zhì)、多肽或抗體樣品中檢測LPS是生物制造和生物加工的一項重要任務(wù)。Portelite 快速熒光法內(nèi)毒素檢測試劑盒使用Endotoxin Green，一種敏感的熒光底物。Endotoxin Green可以在內(nèi)毒素和鱟血細胞提取物鱟素( LAL )的存在下水解，產(chǎn)生強烈的綠色熒光。內(nèi)毒素活性與Endotoxin Green水解產(chǎn)生的熒光強度成正比。Portelite 快速熒光法內(nèi)毒素檢測試劑盒針對Cytocite™和Qubit™熒光儀進行了優(yōu)化，可以檢測樣品中廣泛存在的內(nèi)毒素(從1 EU / ml到0.002 EU / ml)。

樣品分析方案

概述

制備細胞裂解液（LAL）工作溶液

添加大腸桿菌內(nèi)毒素標準品和測試樣品（50µL）

添加LAL工作溶液（50µL）

在37°C下孵育30分鐘

準備并添加Endotoxin Green工作溶液（100µL）

用CytoCite監(jiān)測熒光

溶液配制

儲備溶液配制

1.Endotoxin Green儲備液

對于試劑盒#60008，將50µL DMSO加入一小瓶Endotoxin Green中 （組分A）制備內(nèi)毒素底物儲備溶液。對于試劑盒#60009，將500µL DMSO加入一小瓶Endotoxin Green中 （組分A）制備內(nèi)毒素底物儲備溶液。 注意避光。

2.LAL細胞裂解液儲備液

對于試劑盒#60008，將500µL無內(nèi)毒素水（組分B）添加到LAL試劑瓶（組分C）中，制成5倍LAL儲備溶液。對于試劑盒#60009，將2.5 mL無內(nèi)毒素水（組分B）添加到LAL試劑瓶（組分C）中，制成5倍LAL儲備溶液。

標準溶液配制

E、 大腸桿菌內(nèi)毒素標準溶液

將10µL 100 EU/mL大腸桿菌內(nèi)毒素標準溶液添加到990µL無內(nèi)毒素水（組分B）中，生成1 EU/mL的大腸桿菌內(nèi)毒素溶液。然后取1 EU/mL大腸桿菌內(nèi)毒素標準溶液，在無內(nèi)毒素水（組分B）中進行1:3的連續(xù)稀釋，以獲得連續(xù)稀釋的大腸桿菌內(nèi)毒素1至0.001 EU/mL。

工作溶液配制

1. Endotoxin Green工作溶液

對于試劑盒#60008，添加50µLEndotoxin Green 將儲備溶液溶于5mL無內(nèi)毒素水（組分B）中，使總體積為5.05mL Endotoxin Green工作溶液。對于試劑盒#60009，添加500µLEndotoxin Green 將儲備溶液溶于50mL無內(nèi)毒素水（組分B）中，使總體積為50.5mLEndotoxin Green工作溶液。 注：每次測試需要100µL，請將工作溶液避光，將未使用的儲備溶液儲存在-20°C。

2. LAL工作溶液

對于試劑盒#60008，將500µL LAL細胞裂解液儲備溶液添加到2 mL無內(nèi)毒素水（組分B）中，使總體積為2.5 mL LAL細胞裂解液（LAL）工作溶液。對于試劑盒#60009，將2.5 mL LAL細胞裂解液（LAL）儲備溶液添加到10 mL無內(nèi)毒素水（組分B）中，使總體積為12.5 mL LAL裂解液工作溶液。

操作步驟

1.在0.2 mL PCR管（Cat#CCT100）中制備大腸桿菌內(nèi)毒素標準品、空白對照品或測試樣品（50µL）。

2.向每管大腸桿菌內(nèi)毒素標準品、空白對照品和測試樣品中加入50µL鱟紅細胞裂解液工作溶液。

3.充分混合并在37°C下孵育30分鐘。

4.添加100µLEndotoxin Green 每管內(nèi)毒素標準品、空白對照品和測試樣品的工作溶液，使總分析體積為200µL/孔。

5.將樣本放入CytoCite 并用綠色熒光通道監(jiān)測熒光。

注：為獲得良好結(jié)果，在添加工作溶液后2至10分鐘內(nèi)讀取。

注：可加入50µL 25%乙酸以停止反應。