樣品實驗方案

簡要概述

1. 在測定緩沖液中準備細胞

2. 添加Calbryte 520 AM染料加載溶液（1 µL）

3. 在37°C孵育30分鐘

4. 清洗細胞

5. 添加鈣通量激動劑

6. 在530/30 nm濾光片（FITC通道）使用流式細胞儀檢測熒光強度

溶液配制

儲備溶液配制

Calbryte 520 AM儲備溶液（500X）：在Calbryte 520 AM儲備溶液（組分A）的小瓶中加入100 µL DMSO（未提供），并充分混合。 注意：100 µL Calbryte 520 AM儲備溶液足以進行100次測定。 如果試管密封嚴密，可以將未使用的Calbryte 520 AM原液分裝并在<-20°C下保存超過一個月。 避光并避免重復的凍融循環(huán)。

實驗步驟

1.除去細胞培養(yǎng)基，并加入0.5 mL測定緩沖液。注意：對于貼壁細胞和非貼壁細胞，建議分別使用4 x 105 – 8 x 105和1 x 106-2 X 106。每個細胞系應(yīng)根據(jù)個體情況進行評估，以確定細胞內(nèi)鈣動員的細胞密度。

2.將1µL Calbryte 520 AM儲備溶液（500X）加到0.5 mL非標準或貼壁細胞的測定緩沖液（組分B）中。注意：如果細胞（例如CHO細胞）含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，則可將丙h舒（組分C）添加到染料工作溶液中（孔濃度將為0.125-1 mM），以減少去離子水的泄漏。

3.將細胞在37°C下孵育30分鐘。

4.對于非貼壁細胞，將細胞離心并去除染料。將細胞重懸于0.4 mL HHBS（組分D）中。對于貼壁細胞，使用0.5 mM EDTA輕輕地將細胞從板中提起并離心。將細胞重懸于0.4 mL HHBS（組分D）中。注意：要從板上分離貼壁細胞，可以考慮使用酶試劑（例如胰dan白酶，Accutase），但需要進行測試以確保細胞表面上的目標受體不受影響。

5.用HHBS或所需的緩沖液制備5X激動劑化合物。

6.使用530/30 nm濾光片（FITC通道）在流式細胞儀上檢測，在添加100 µL制備的激動劑之前和之后分析樣品。注意：為獲得結(jié)果，重要的是在添加激動劑后1分鐘內(nèi)進行測定。確保激動劑添加到實際讀數(shù)開始之間的時間對于所有樣品保持恒定。