樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 添加測試化合物

3. 添加MitoTell Orange工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板）

4. 將板在5％CO2、37°C的培養(yǎng)箱中孵育15-30分鐘

5. 添加測定緩沖液B（50 µL /孔/ 96孔板或12.5 µL /孔/ 384孔板）

6. 檢測Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）的熒光增加（底部讀取模式）

溶液配制

工作溶液配制

將50 µL的200X MitoTell 橙色（組分A）添加到10 mL的測定緩沖液A（組分B）中，并充分混合以制成MitoTell Orange工作溶液，避光。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.用測試化合物處理細(xì)胞一段時(shí)間，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并建立平行對照實(shí)驗(yàn)。

陰性對照：僅用載體處理細(xì)胞。

陽性對照：在37°C 5％CO2培養(yǎng)箱中，以5-50 µM的濃度用FCCP或CCCP處理細(xì)胞15至30分鐘。 注意：CCCP或FCCP可以與MitoTell Orange同時(shí)添加。 為了獲得結(jié)果，可能需要為每個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞系滴定CCCP或FCCP。

2.取出細(xì)胞培養(yǎng)基。注意：在添加MitoTell Orange工作溶液之前，必須除去細(xì)胞培養(yǎng)基。

3.將100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板的MitoTell Orange工作溶液添加到細(xì)胞板中。

4.將板在5％CO2、37°C的培養(yǎng)箱中避光放置15-30分鐘。注意：適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所用的單個(gè)細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。

5.將50 µL /孔/ 96孔板或12.5 µL /孔/ 384孔板的測定緩沖液B（組分C）添加到細(xì)胞板中。注意：加載后請勿洗滌細(xì)胞。對于非貼壁細(xì)胞，建議在加入測定緩沖液B（組分C）后，以800 rpm離心細(xì)胞板2分鐘，然后制動(dòng)。

6.在加入分析緩沖液B（成分C）10至30分鐘后，使用熒光酶標(biāo)儀（底部讀取模式）在Ex/Em=640/680 nm（截止=665 nm）處檢測熒光強(qiáng)度，可以使用終點(diǎn)模式，也可以使用動(dòng)力學(xué)模式。