樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1. 用5×105至1×106細(xì)胞/ mL的密度制備含測(cè)試化合物的細(xì)胞

2. 將5 µL 200X MitoLite NIR加入1 mL細(xì)胞溶液中

3. 在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞15-30分鐘

4. 沉淀細(xì)胞，并將細(xì)胞重懸于1 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中

5. 使用帶有FL4通道的流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞

操作步驟

1.對(duì)于每個(gè)樣品，在1 mL溫暖的培養(yǎng)基或您選擇的緩沖液中以5×105至1×106細(xì)胞/ mL的密度制備細(xì)胞。 注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每種細(xì)胞系，以確定誘導(dǎo)凋亡的佳細(xì)胞密度。

2.用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段時(shí)間，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并建立平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

陰性對(duì)照：僅用載體處理細(xì)胞。

陽(yáng)性對(duì)照：在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，以5-50 µM的濃度用FCCP或CCCP處理細(xì)胞15至30分鐘。 注意：CCCP或FCCP可以與MitoLite NIR同時(shí)添加。 為了獲得佳結(jié)果，可能需要為每個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞系滴定CCCP或FCCP。

3.向處理過的細(xì)胞中加入5 µL 200X MitoLite NIR（組分A）。

4.將細(xì)胞在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育15至30分鐘。 注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，在用MitoLite NIR染料上樣溶液孵育之前，用0.5 mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并用含血清的培養(yǎng)基洗滌一次。

5.以1000 rpm離心細(xì)胞4分鐘，然后將細(xì)胞重懸于1 mL分析緩沖液（組分B）或您選擇的緩沖液中。

6.使用帶有FL4通道的流式細(xì)胞儀（Ex / Em = 635/660 nm）檢測(cè)熒光強(qiáng)度。