樣品實驗方案

簡要概述

運行激酶反應(yīng)（20μL）
添加ADP傳感器緩沖液（20μL）
添加ADP傳感器工作溶液（10μL）
在室溫下孵育15分鐘--1小時
監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm處的熒光強(qiáng)度（截止= 570nm）

溶液配制

1.儲備溶液配制

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。
1. 1ADP Sensor I儲備溶液（50X）：
將50μLDMSO（組分B3）加入到ADP傳感器1（組分B1）的小瓶中，制備50X ADP傳感器I儲備溶液。

1.2ADP標(biāo)準(zhǔn)溶液（300 mM）：
向ADP標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）中加入100μLDdH2O，制成300mM ADP標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

ADP標(biāo)準(zhǔn)配制
取300 mM ADP標(biāo)準(zhǔn)溶液，在激酶反應(yīng)緩沖液中稀釋10,000倍，制成30μMADP標(biāo)準(zhǔn)溶液。 取30μMADP標(biāo)準(zhǔn)溶液，在激酶反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到ADP標(biāo)準(zhǔn)溶液的連續(xù)稀釋液。 注意：通過包含不含ADP的樣品來測量背景熒光，在激酶反應(yīng)緩沖液中連續(xù)稀釋ADP標(biāo)準(zhǔn)品。

3.工作溶液配制

將50μL50XADP Sensor I儲備溶液加入到ADP Sensor II（組件B2）的樣品瓶中，制成ADP Sensor工作溶液。 注意：重組的ADP不穩(wěn)定，可根據(jù)需要制作新鮮溶液，隨用隨配。

操作步驟

1.運行激酶反應(yīng)（此步驟不提供試劑）：

1.1根據(jù)需要制備20μL（或?qū)τ?84孔板10μL）激酶反應(yīng)溶液/孔。 應(yīng)根據(jù)需要優(yōu)化激酶反應(yīng)的組分（例如，特定激酶反應(yīng)可能需要優(yōu)化的緩沖系統(tǒng)）。 在大多數(shù)情況下，如果您沒有優(yōu)化的激酶緩沖液，ADP檢測緩沖液（組分D）也可用于運行激酶反應(yīng)。

1.2Amplite 熒光激酶檢測試劑盒用于確定ADP的形成。

2.運行Amplite ADP分析：

2.1將20μLADP緩沖液（組分A）和10μLADP工作溶液加入每個充滿20μL激酶反應(yīng)溶液的孔中，使總ADP測定體積為50μL/孔。 對于384孔板，在每個充滿10μL激酶反應(yīng)溶液的孔中加入10μLADP傳感器緩沖液（組分A）和5μLADP，使總ADP測定體積為25μL/孔。

2.2將反應(yīng)混合物在室溫下孵育15分鐘至1小時。

2.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測熒光強(qiáng)度。

3.生成ADP校準(zhǔn)曲線（篩選激酶抑制劑不需要）：

3.1添加20μL（對于96孔板）或10μL（對于384孔板）/孔ADP傳感器緩沖液（組分A）和10μL（對于96孔板）或5μL（對于384） （間隔板）ADP傳感器進(jìn)入連續(xù)稀釋的ADP標(biāo)準(zhǔn)品的每個孔中，使每個反應(yīng)的總體積為50μL（對于96孔板）或25μL（對于384孔板）。

3.2將反應(yīng)混合物在室溫下孵育15分鐘至1小時。

3.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測熒光強(qiáng)度。

3.4生成ADP標(biāo)準(zhǔn)曲線。