Amplite 熒光法酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒 紅色熒光是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)鞘磷脂的試劑盒，鞘磷脂酶（SMase）是一種酶，負(fù)責(zé)將鞘磷脂（SM）切割成磷酸*堿和神經(jīng)酰胺。SMase的在細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用，例如細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，細(xì)胞分化，細(xì)胞周期停滯和程序性細(xì)胞死亡。已經(jīng)基于它們的陽(yáng)離子依賴性和佳作用pH鑒定了五種類型的鞘磷脂酶（SMase）。 它們是溶酶體酸性SMase，分泌鋅依賴性酸性SMase，鎂依賴性中性SMase，鎂非依賴性中性SMase和堿性SMase。在五種類型的鞘磷脂酶中，溶酶體酸性SMase和鎂依賴性中性SMase被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的主要因素。

我們的Amplite 熒光酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒是檢測(cè)酸性SMase活性或篩選其抑制劑的靈敏方法之一。該試劑盒使用Amplite™Red作為熒光探針，間接定量鞘磷脂酶（SMase）水解鞘磷脂（SM）產(chǎn)生的磷酸*堿。Amplite Red的熒光強(qiáng)度與磷酸*堿的形成成正比，因此與SMase活性成正比。 它可用于測(cè)量血液，細(xì)胞提取物或其他溶液中的SMase活性。該試劑盒是一種優(yōu)化的“混合和讀數(shù)"測(cè)定，與HTS液體處理儀器兼容。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 熒光法酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒 紅色熒光。

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備鞘磷脂工作溶液（50μL）

添加SMase標(biāo)準(zhǔn)品和/或SMase測(cè)試樣品（50μL）

在37°C孵育1-2小時(shí)加入鞘磷脂酶測(cè)定混合物（50μL）

在室溫下孵育持續(xù)1-2小時(shí)

監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm處的熒光強(qiáng)度（在570 nm處截止）

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分的一個(gè)小瓶（或瓶）。

操作方法

1.準(zhǔn)備鞘磷脂工作液：

將50μL鞘磷脂（組分B）加入5mL SMase反應(yīng)緩沖液（組分D）中，并充分混合。

注意：應(yīng)及時(shí)使用鞘磷脂工作液。

2.制備鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品和/或含鞘磷脂酶的樣品：

2.1將20μL含0.1％BSA的PBS加入到鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品（組分F）的小瓶中，制成10單位/ mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

注意：應(yīng)將未使用的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液等分并保存在-20℃。

2.2將1μL的10單位/ mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（來(lái)自步驟2.1）加入1000μL測(cè)定緩沖液（組分E）中以產(chǎn)生10mU / mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品。

注意：稀釋的鞘磷脂標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

2.3取500μL10mU / mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行1至2次連續(xù)稀釋，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 mU / mL連續(xù)稀釋的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品。

2.4將連續(xù)稀釋的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品和/或含鞘磷脂酶的測(cè)試樣品加入固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中，如說(shuō)明書中的表1和2所示。

注意：根據(jù)需要處理您的細(xì)胞或組織樣本。

2.5將50μL鞘磷脂工作溶液（來(lái)自步驟1）加入到鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（來(lái)自步驟2.4）。

2.6將反應(yīng)混合物在37℃下孵育1-2小時(shí)。

3.準(zhǔn)備200X Amplite Red原液：

將80μLDMSO（組分G）加入到Amplite Red（組分C）的小瓶中以制備200X Amplite Red儲(chǔ)備溶液。

注意1：未使用的Amplite Red原液應(yīng)等分并保存在-20℃（避光）。

注意2：在硫醇（如DTT和2-巰*乙醇）存在下，Amplite Red不穩(wěn)定。反應(yīng)中DTT或2-巰*乙醇的終濃度應(yīng)低于10μM。 Amplite Red在高pH（> 8.5）下也不穩(wěn)定。反應(yīng)應(yīng)在pH 7-8下進(jìn)行。建議將pH 7.4用于測(cè)定緩沖液。

4.準(zhǔn)備鞘磷脂酶測(cè)定混合物：

4.1將5 mL測(cè)定緩沖液（組分E）加入酶混合物瓶（組分A）中，并充分混合。

4.2在開始測(cè)定之前，將25μL的200X Amplite Red儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟3）加入到酶混合物溶液瓶（來(lái)自步驟4.1）中以制備鞘磷脂酶測(cè)定混合物。

注意：應(yīng)立即使用鞘磷脂酶試驗(yàn)混合物并避光; 較長(zhǎng)的儲(chǔ)存可能會(huì)導(dǎo)致高分析背景。

5.運(yùn)行鞘磷脂酶測(cè)定：

5.1將50μL鞘磷脂酶測(cè)定混合物（來(lái)自步驟4.2）加入鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品（來(lái)自步驟2.4）的每個(gè)孔中，以使總鞘磷脂酶測(cè)定體積為150μL/孔。

注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品，25μL鞘磷脂工作溶液和25μL鞘磷脂酶測(cè)定混合物。

5.2在室溫下孵育反應(yīng)混合物1-2小時(shí)（避光）。

5.3使用熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 540 / 590nm（在570nm處截止）觀察熒光增加。