樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1.準(zhǔn)備ELISA板
2.準(zhǔn)備過氧化物酶工作溶液
3.將100μL/孔的過氧化物酶工作溶液加入ELISA板中
4.在室溫下孵育15-60分鐘
5.監(jiān)測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度

溶液制備

1.儲備溶液

所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。
1.1Amplite 紅色過氧化物酶底物儲備液（200X）：
將250μLDMSO（組分D）加入到Amplite 紅色過氧化物酶底物（組分A）的小瓶中。 注意：50μL的Amplite 紅色過氧化物酶底物原液足以用于1個(gè)平板。

1.2 H2O2儲備溶液（20 mM）：
將22.7μL的3％H2O2（0.88M，組分B）加入977μL的測定緩沖液（組分C）中。 注意：稀釋的H2O2儲備溶液不穩(wěn)定，應(yīng)丟棄未使用的部分。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液

小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)
小鼠IgG（未包括）可用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。 使用初始濃度3μg/ mL和1：3稀釋因子，將0.2M碳*氫鈉緩沖液（pH9.4）的總小鼠IgG稀釋到微量培養(yǎng)板中。

3.工作溶液

3.1 山羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物工作液：
將2μL山羊抗小鼠IgG-HRP綴合物（組分E）加入10mL含1％BSA的PBS（PBS-BSA，不包括在內(nèi)）中。 注意：10 mL山羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物工作溶液足以用于1個(gè)平板。 推薦該山羊抗小鼠IgG-HRP綴合物工作溶液的濃度作為初始濃度。應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定每種特定應(yīng)用的佳濃度。

3.2 過氧化物酶工作溶液：
將50μL的Amplite 紅色過氧化物酶底物儲備溶液（200X）和100μL的H2O2儲備溶液（20mM）加入9.85mL的測定緩沖液（組分C）中以制備總體積為10mL的過氧化物酶工作溶液，避光。

樣品分析

1.準(zhǔn)備ELISA板：

1.1執(zhí)行所有必要的ELISA準(zhǔn)備步驟。

1.2用含有0.02％至0.05％Tween 20（PBS-Tween）和排液的PBS洗滌ELISA孔三次。

1.3向每個(gè)孔中加入100μL制備的山羊抗小鼠IgG-HRP綴合物工作溶液。

1.4在室溫下孵育30分鐘。 排出HRP結(jié)合物。

1.5用PBS-Tween洗滌孔三次并排干。

2.在ELISA板中運(yùn)行過氧化物酶測定：

2.1在含有樣品和對照的每個(gè)排出的微孔板中加入100μL過氧化物酶工作溶液。

2.2在室溫下孵育反應(yīng)30分鐘或更長時(shí)間，避光。

2.3用激發(fā)530-570nm（佳540nm）和發(fā)射590-600nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測熒光增加。 注意：也可以用吸光度酶標(biāo)儀在576±5 nm的波長下讀板。 然而，與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測具有更低的靈敏度。