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原位雜交（DAB顯色）價格:240元
一.原位雜交（DAB顯色）項目介紹：
1. 原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。
2. 所需器材：
恒溫箱，高壓滅菌鍋，移液槍，鐘擺搖床。
3. 主要試劑：DEPC。原位雜交固定液。PBS緩沖液。20×SSC洗脫液。蛋白酶K。蘇木素染液。中性樹膠。雜交液。HRP二抗。DAB顯色劑。
二.石蠟切片DAB顯色原位雜交實驗步驟:
1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。
2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。
3、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h。
4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。
5、消化：根據(jù)組織固定時間長短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。
6、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
7、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。
8、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針 雜交液, 濃度 ，恒溫箱 度雜交過夜。
9、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。
10、滴加封閉液：滴加封閉血清 BSA 。室溫30min。
11、滴加鼠抗DIGAOXING標(biāo)記過氧化物酶（anti-DIG-HRP）：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。
12、DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。
13：復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。
14：脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—BAIFENZHIYIBAI酒精I 6min—BAIFENZHIYIBAI酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，中性樹膠封片。
15、顯微鏡檢，圖像采集分析。
結(jié)果判讀：陽性為棕黃色，細(xì)胞核為藍(lán)色。
!注意事項：mRNA為檢測對象時，需嚴(yán)格要求實驗環(huán)境經(jīng)無RNA酶處理。
環(huán)保在線