Bst 4.0 Basic Mix(with UDG)

該制品為雙組分的試劑，Basic Buffer Mix 包含了反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dU/A/C/GTP(不含 dTTP)、凍干賦形劑，酶 Mix 包含 Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶、熱敏 UDG。得益于 Bst 4.0 識別 dUTP 底物，反應(yīng)底物中不包含dTTP，因此擴增產(chǎn)物均為 dUTP 產(chǎn)物，在配合熱敏 UDG的情況下，實現(xiàn)防污染性能。在實際測試中，含有 10e5Copies 的污染物的條件下，抑制污染擴增。本制品尤其適用于開蓋的 LAMP 反應(yīng)（如試紙條檢測）、密封腔體（污染風(fēng)險較高）的檢測試驗（如定量 PCR腔體）。
試劑使用特點：
（1）Basic Buffer Mix 中不含染料，可自行添加 SYBR Green、Eva Green 等染料進行熒光檢測。
（2）本試劑適用于開蓋檢測如核酸試紙條檢測。
（3）試劑中含有凍干賦形劑，試劑可直接凍干，無需再優(yōu)化凍干配方。

儲存：-20℃保存 1 年；-80℃保存 2 年；短期使用放置于2-8℃，保存 1 個月。反復(fù)凍融 10 次，不影響使用。如有白色沉淀，于 37℃水浴放置 10min 后溶解沉淀，不影響使用。
使用方法：
1. 配制 LAMP 反應(yīng)體系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 4~8 μM、F3/B3 分別為 2 μM。
注意：如何應(yīng)用核酸試紙條進行特異性檢測，可來信咨詢。
2. 反應(yīng)體系配好后，室溫（25-37°C）放置 2min，以消化去除潛在的核酸污染，隨后置于 65°C 進行反應(yīng)15~30min。
試劑凍干策略（有凍干經(jīng)驗人員操作）：
1. 配制 LAMP 凍干體系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
ddH2O 到體積 1.5 μl
凍干總體積 15 μl
2. 體系配制完畢后，加入 0.2 ml EP 管進行上機凍干。該試劑的凍干體積為 15 μl， 檢測反應(yīng)體積為 25 μl。

特別說明：
（1）本試劑防污染原理為：熱敏 UDG 消化去除含有 dUTP的擴增產(chǎn)物，熱敏 UDG 在隨后 50℃以上迅速失活，并不影響后續(xù) LAMP 擴增。因此，本試劑無法去除采用 dTTP擴增的污染物，也不能消化天然的核酸底物（DNA/RNA）。為避免擴增氣溶膠污染，實驗室應(yīng)長期使用本試劑進行實驗，一旦使用 dTTP 試劑擴增后，造成實驗室污染，采用本試劑不會消除假陽性擴增。
（2）本試劑適用基于 OG 染料變色法、SYBR Green 法、基于 Biotin/FAM 探針的核酸膠體金法（ 具有膠體金法特異性使用策略，如需技術(shù)支持，請來信咨詢）。本試劑不支持 HNB、pH 顯色法。其它使用策略自行優(yōu)化調(diào)整。
（3）基于本試劑， 提供凍干制備服務(wù)。八聯(lián)管起訂量 480T，凍干球起訂量 2000T。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。