Bst 4.0 HNB Bead

本品為全組分凍干品試劑，包含了標準反應(yīng)緩沖液、HNB 染料、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用時只需要加入引物、模板即可進行核酸恒溫擴增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉(zhuǎn)錄），還具有依賴于 DNA 的聚合酶活性，因此無論 DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進行高效的恒溫擴增。該制品是進行 LAMP 及 RT-LAMP 擴增反應(yīng)的試劑。優(yōu)化的反應(yīng)體系，確保快速的完成檢測試劑的反應(yīng)體系建立。在 LAMP 擴增起始前 HNB 染料與 Mg2+結(jié)合表現(xiàn)出肉眼可見的紫羅蘭色，當(dāng)陽性擴增發(fā)生時 Mg2+被 LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸螯合，HNB 染料無法與 Mg2+結(jié)合表現(xiàn)出肉眼可見的天藍色。由此判斷天藍色為陽性擴增。該顯色方法受樣本緩沖鹽、pH 等影響較小，適用的樣本較pH 顯色法通用性更強。

儲存：-20℃保存 2 年；室溫（25℃）保存>6 個月。使用凍干微球進行全擴增體系用品的制備方法：將優(yōu)化的擴增引物分裝于 0.2 ml EP 管底部，于 70-80℃條件烘干1-2h。烘干后的 0.2 ml EP 管已經(jīng)含有干燥的擴增引物，再加入一粒凍干微球即可制備成全擴增體系干燥品，該干燥品無需冷鏈運輸，可長期保存。

反應(yīng)體系說明：每一個凍干微球為按照 25 μl 反應(yīng)體系建立，在使用時只需要加入 25 μl 的 ddH2O 或模板即可進行反應(yīng)。
使用實例：
1. 配制反應(yīng)體系
在 0.2 ml EP 反應(yīng)管中加入下述試劑
Bst4.0 HNB Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到液體總量 25 μl
10xLAMP Primer Mix
濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 8 μM、F3/B3 分別為 2 μM
2. 反應(yīng)體系配好后，置于65°C進行反應(yīng)25~45min。肉眼觀察結(jié)果，天藍色為陽性，紫羅蘭色為陰性。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。