RCA滾環(huán)擴(kuò)增試劑盒

描述：滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）是新近 發(fā)展起來(lái)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法。以環(huán)狀 DNA 為模板， 通過(guò)一個(gè)短的 DNA 引物（與部分環(huán)狀模板互補(bǔ)），在 phi29 DNA 聚合酶催化下將dNTPs轉(zhuǎn)變成單鏈DNA，此單鏈DNA 包含成百上千個(gè)重復(fù)的模板互補(bǔ)片段。這種方法不僅可以直 接擴(kuò)增 DNA 和 RNA，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的信號(hào)放大，靈 敏度達(dá)到一個(gè)拷貝的核酸分子。 本試劑盒配備的 RCA Mix 預(yù)混合液，使用方便，簡(jiǎn)化 了操作步驟，RCA Mix 為 4X 濃度，內(nèi)含 Equi-phi29 DNA Polymerase、dNTP Mix、無(wú)機(jī)焦磷酸酶等。試劑盒配備的 Random Hexamers 為 6 堿基隨機(jī)引物可對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行指 數(shù)放大（通常放大 10000 倍），特殊的實(shí)驗(yàn)可自行搭配相關(guān) 引物。 

組分
名稱(chēng) 50T
4xRCA Mix 250 μl
10XRandom Hexamer 100 μl
RNase Free H2O 1 ml
儲(chǔ)存：-20℃可保存 3 年。
操作方法
1. 配制引物模板退火體系
Template DNA 0.1-40 ng
10XRandom Hexamer 2 μl
ddH2O Upto 15 μl
注意：在不同的實(shí)驗(yàn)類(lèi)型中，Oligo根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行選擇。
2. 引物和模板退火：體系配制完畢后，放置到 PCR 儀中，95℃ 3min，25℃ 3min。
3. 退火完畢后，向退火產(chǎn)物中加入 5μl 的 4xRCA Mix，混合均勻。
4. 擴(kuò)增反應(yīng)
4.1 恒溫?cái)U(kuò)增
對(duì)于環(huán)狀DNA模板采用恒溫反應(yīng)作為推薦使用30℃恒溫?cái)U(kuò)增，30℃孵育 6-16h.該酶在 30-42℃條件下均可工作，必要時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型進(jìn)行調(diào)整。
4.2 變溫?cái)U(kuò)增
對(duì)于基因組 DNA 或 cDNA 模板，推薦使用變溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，以在短時(shí)間內(nèi)獲得更高產(chǎn)量，并提高了低濃度模板的擴(kuò)增產(chǎn)量。在 PCR 儀上做如下設(shè)置：
【30℃ 5min；42℃ 15s】循環(huán) 72 次（約 6h）或 120次（約 10h）.必要時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，可于 65°C 10min 進(jìn)行失活反應(yīng)。
注意：
RCA 擴(kuò)增還可應(yīng)用于其它缺刻或診斷相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，此時(shí)Random Hexamer 為非必須品。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。