5min RNA純化試劑盒

描述：RNA 純化試劑盒的優(yōu)點為迅速僅需 5min 即可完成操作，回收率可高達 70～95％。該試劑盒采用 高特異吸附能力的硅膠吸附柱，應用優(yōu)化好的特定緩沖 液，可選擇性地結合回收目標 RNA，并去除雜蛋白、鹽 等。該試劑盒每次可純化得到高達 50 μg 的 RNA 片段 (>15nt)，回收的產(chǎn)物可直接用于 RT-PCR、用于 NGS 的 RNA 文庫制備、基因編輯、顯微注射、RNA 標記、轉染 等。

 組分

自備試劑：75%乙醇。
儲存：室溫保存，有效期 2 年。
操作方法
1. 向 50 µl 待回收樣品中加入 100 µl RNA CleanupBinding Buffer 用槍頭吹打混合均勻。
注意：若樣品不足 50 µl 需加入 RNase Free H2O 補至 50 µl；若樣品大于 50 µl 則可按比例縮放緩沖液體積，當樣品大于 150 µl 時應上兩根吸附柱。
2. 向上述溶液中加入預冷 150 µl 無水乙醇（等體積），槍頭吹打混合均勻。（當 15nt<RNA<25nt 時可加入 2倍體積的無水乙醇）。
3. 將上述溶液共 300 µl 加入到吸附柱中，室溫靜置 30s。4℃ 13,000rpm 離心 30s，棄去過柱液。
4. 向吸附柱中加入預冷的 700 µl 75%乙醇，4℃13,000rpm 30s，棄去過柱液，重復此步驟一次。
5. 13,000rpm 空離 2min 后，將吸附柱轉移至新的 1.5ml收集管中，室溫放置 2min 使殘留乙醇揮發(fā)。
6. 向吸附柱芯中加入 50~100 µl RNase Free H2O，室溫靜置 1min 后，4℃ 13,000rpm 離心 2min，獲得的產(chǎn)物即為純化的 RNA?？闪⒓词褂没蛴?80℃保存。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。