6min Fast 1st cDNA Synthesis Kit

描述：本試劑盒采用穩(wěn)定高效的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混體系 5×Fast RT MasterMix 進(jìn)行 RNA 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用時(shí)只需加入模板、 引物和 RNase Free H2O 即可，大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程、提高 了效率、減少了操作過(guò)程中的人為誤差。 該預(yù)混體系包含快速 MLV7 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、反應(yīng) Buffer 和 RNase Inhibitor。該試劑盒采用的 MLV7 反轉(zhuǎn)錄酶 具有以下特性：RNase H 活性缺失，從而避免反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中 降解 RNA；經(jīng)過(guò)突變文庫(kù)篩選，使得其熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，可耐 受 50℃ 高溫反應(yīng)，在 60℃ 條件下仍然具有 30%以上活性， 利于打開(kāi) RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而提高復(fù)雜 RNA 模板的擴(kuò)增性 能；含有快速合成結(jié)構(gòu)域，將 MLV 的延伸速度提高了 3-4 倍，因此適用于快速反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄 Buffer 系統(tǒng)， 可以獲得更高產(chǎn)量的 cDNA，從而提高后續(xù)檢測(cè)的靈敏度。 合成的鏈 cDNA 可廣泛用于 2nd Strand 的合成、雜交、 PCR 擴(kuò)增、Real-Time PCR 反應(yīng)等。

應(yīng)用：
（1）該制品可有效反轉(zhuǎn)錄 mRNA、tRNA、LncRNA、ncRNA
（2）該制品不可反轉(zhuǎn)錄 microRNA
組分

儲(chǔ)存：請(qǐng)置于-20°C，可保存 3 年；避免反復(fù)凍融。
1. 按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
Total RNA or Poly(A) RNA 0.1-2 μg
5×Fast RT MasterMix 4 μl
*20×Oligo dT(25)&Random Primer 1 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
*注：反轉(zhuǎn)錄引物可根據(jù)需要改用特異性引物。
2.反應(yīng)程序
 50°C 5 min（cDNA 合成）
 95°C 1 min（失活 MLV）
3. 采用 0.25-2μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為后續(xù)定量 PCR 或 PCR的擴(kuò)增模板即可。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。