BCA Protein Assay Kit

描述：BCA 蛋白質定量試劑盒是根 據(jù)目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法之一－BCA （bicinchoninic acid）法改良研制而成，該試劑盒具有蛋白 濃度測定的簡單性，高穩(wěn)定性，高靈敏度和高兼容性。本試 劑盒的原理是蛋白質分子中的肽鍵結構在堿性環(huán)境下能與 Cu2+絡合生成絡合物，將 Cu2+還原成 Cu+，而 BCA 試劑可 敏感特異地與 Cu+結合，形成穩(wěn)定的有顏色的復合物，并在 562nm 處有最大光吸收值，該復合物顏色深淺與蛋白質濃度 成正比，可根據(jù)吸收值的大小來測定蛋白的含量，1 小時內 即可完成蛋白定量檢測。本試劑盒含有牛血清白蛋白（BSA） 溶液作為蛋白質標準溶液，測定范圍為 25～2000 μg/ml。該 試劑盒可用于 20 次試管檢測或 200 次 ELISA 板檢測。

操作方法
1. 標準品的稀釋：按下表將 BSA 進行稀釋。
管號 PBS
BSA 體積
（來源）
BSA 終濃度
（μg/ml）
A 0 300 μl (母液) 2000
B 125 μl 375 μl (母液) 1500
C 325 μl 325 μl (母液) 1000
D 175 μl 175 μl (B 管) 750
E 325 μl 325 μl (C 管) 500
F 325 μl 325 μl (E 管) 250
G 325 μl 325 μl (F 管) 125
H 400 μl 100 μl (G 管) 25
I 400 μl 0 0
2. BCA 工作液的配置：根據(jù)樣品數(shù)量及測定方法，將 BCA Reagent A 和 BCA Reagent B 按體積比 50:1充分混勻即可。
注意：配制 BCA 工作液前請將 BCA Reagent A 混勻。
3. 標準比色杯測定方法
(1)吸取 0.1 ml 的各標準品和待測樣品置于合適的管中。
(2)加入 2 ml BCA 工作液，充分混勻。
(3)37℃孵育 30 min，然后室溫靜置 10 min。
(4)紫外分光光度計于 562 nm 處檢測吸光度。
(5)繪制標準曲線。
(6)根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。
4. 微管測定方法
(1)分別取 25 μl 新鮮配制的 BSA 標準液和待測樣品，加入到 ELISA 反應板中。
(2)每孔加入 200 μl BCA 工作液，充分混勻。
(3)37℃孵育 30 min，然后室溫靜置 10 min。
(4)酶標儀于 562nm 處檢測吸光度。
(5)繪制標準曲線。
(6)根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。
注意事項
1. 待測樣品濃度在 25~2000 μg/ml 的范圍內具有良好的線性關系。
2. BCA 工作液配制后 24 小時內使用效果穩(wěn)定。
3. BCA 法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。
4. 使用普通的分光光度計測定時，需根據(jù)比色皿的最小檢測體積，適當加大 BCA 工作液的用量，使其不小于最小檢測體積，樣品和標準品的用量可相應按比例調整。
5. 適用范圍

實例操作 按上述操作方法可得到如下標準工作曲線，該線性方程經過 多次繪制，系數(shù)均為 0.0001，且 R 2 值均在 0.99~1 之間， 重復性好，在計算蛋白濃度時可直接用該標準工作曲線進行 計算。例如：在 562 nm 處檢測吸光值為 0.1，則此時 y 值 為 0.1，代入方程 y=0.0001x 中，可得蛋白濃度為 1000 μg/ml。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。