T5核酸外切酶

產(chǎn)T5 核酸外切酶沿 5’-3’方向降解 DNA，它可降解雙鏈DNA、單鏈 DNA 和缺刻的質(zhì)粒 DNA。它既能從 5’-末端起始降解 DNA，也能從線性或環(huán)狀雙鏈 DNA 的切刻或缺口處起始降解 DNA，但不能降解超螺旋雙鏈 DNA?；谝陨咸匦?，T5 核酸外切酶可應(yīng)用于 Gibson 組裝。
儲存：-20℃可保存 3 年。
活性定義：1 單位指在 50 μl 反應(yīng)體系，37°C 條件下，30分鐘內(nèi)能從雙鏈 DNA 底物上催化產(chǎn)生 1 nmol 的酸可溶性脫氧核糖核苷酸所需要的酶量。
使用注意事項：
（1）1×T5 Exo Buffer：50mM KAc，20mM Tris-Ac pH 7.9，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT。該酶在 PCR Buffer 中也具有活性。
（2）該酶的反應(yīng)溫度為 37°C，在 50°C 也具有一定活性，因此可用于 Gibson 組裝。
使用方法：
1.建立如下反應(yīng)體系
模板 DNA 1 μg
10×T5 Exo Buffer 5 μl
T5 Exonuclease (10 U/μl) 1 μl
ddH2O upto 50 μl
2. 37°C，30min。
3. 加入 EDTA 至總濃度為 11mM，終止反應(yīng)。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。