結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤原代細(xì)胞提取物【Human Colon MatchPair: Normal Colonic Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】
人結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤原代細(xì)胞提取物是從人原代結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中提取的，人原代結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分別從正常人結(jié)腸組織和腫瘤組織中制備。正常人結(jié)腸組織和腫瘤組織采集自各地方醫(yī)院，采集工作根據(jù)IRB 和 HIPAA批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆，表達(dá)圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究。
總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進(jìn)行純化。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測(cè)定結(jié)果等。

cDNA制備：純化后的總RNA來(lái)合成cDNA一鏈，以50ul總反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及10mg總RNA。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng)。利用1x RT Buffer 運(yùn)輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng)。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的QA/QC分析，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。

蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤原代組織裂解液，離心去除組織碎片，通過(guò)Bio-Rad蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

潛在的應(yīng)用： <1>已知基因的PCR克?。?lt;2>mRNA選擇性剪接；<3>基因克隆與目標(biāo)測(cè)序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白檢測(cè)與蛋白質(zhì)組學(xué)；<6>芯片研究與表達(dá)圖譜。

操作要點(diǎn)：
1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。
5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)：
1. 接收到細(xì)胞，肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過(guò)的）。
3.嚴(yán)格無(wú)菌操作，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4.將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴(yán)禁直接傾倒），放入另一無(wú)菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細(xì)胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細(xì)胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細(xì)胞。
7.換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。 

AMYLOGLUCOSIDASE滅多威（萬(wàn)靈） 標(biāo)準(zhǔn)品anti- LAMA4 antibody肌球蛋白重鏈1(MYH1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

SUCCINYL CHLORIDE烯酰嗎啉 標(biāo)準(zhǔn)品anti- LAMB1 antibody肌球蛋白重鏈1(MYH1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

DI-TERT-BUTYL ACETYLENEDICARBOXYLATE烯酰嗎啉 標(biāo)準(zhǔn)品anti- LAMC2 antibody肌球蛋白重鏈2(MYH2)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

CHLOROMETHYL BUTYRATE烯酰嗎啉 標(biāo)準(zhǔn)品anti- LAMC3-Specific antibody腫瘤壞死因子受體超家族成員8(TNFRSF8)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

(R)-Glycidyl butyrate烯酰嗎啉 標(biāo)準(zhǔn)品anti- Lamin A/C antibody蛋白激酶Cθ(PKCθ)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

Picloram多菌靈 標(biāo)準(zhǔn)品anti- Lamin B1 antibody叉頭框蛋白M1(FOXM1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

1,1,1,2-Tetrafluoroethane多菌靈 標(biāo)準(zhǔn)品anti- Lamin B1 antibody表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

4-AMinoazobenzene;p-AMino-azobenzene;p-AMinodiphenyliMide;Aniline yellow;Spirit yellow;Oil yellow B;p-Phenylazoaniline;C.I.11000;多菌靈 標(biāo)準(zhǔn)品anti- LAMP1 antibody抗繆勒管激素(AMH)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤原代細(xì)胞提取物Corynebacterium glutamicum (Kinoshita et al ..層粘蛋白α1抗體Human ANXA1(Annexin A1) ELISA Kit白介素17F(IL17F)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

Cryptococcus lupi Baharaeen et Vishniac, an ..富重復(fù)激酶2抗體Human NCOR2(Nuclear receptor corepressor 2) ELISA Kit色素上皮衍生因子(PEDF)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..肺耐藥相關(guān)蛋白抗體Human NCOA1(Nuclear receptor coactivator 1) ELISA Kit成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3(FGF3)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

Schizosaccharomyces pombe Lindner低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6抗體Human GRIN1(Glutamate Receptor, Ionotropic, N-Methyl-D-Aspartate 1) ELISA Kit成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3(FGF3)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

Homo sapiens, human lung腦啡肽抗體Human HEPH(Hephaestin) ELISA Kit顆粒體蛋白(GRN)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

Homo sapiens, human乳酸脫酶抗體Human C1QC(Complement C1q subcomponent subunit C) ELISA Kit顆粒體蛋白(GRN)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

Nectria albida Rossman, teleomorphLETM1蛋白抗體Human SIRT4(NAD-dependent ADP-ribosyltransferase sirtuin-4) ELISA Kit心營(yíng)養(yǎng)素樣細(xì)胞因子1(CLCF1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..溶酶體相關(guān)膜蛋白3抗體Human GDF11(Growth/differentiation factor 11) ELISA Kit心營(yíng)養(yǎng)素樣細(xì)胞因子1(CLCF1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)

培養(yǎng)步驟：

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。