類器官蛋白提取方法：

一、試劑準(zhǔn)備（細(xì)胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒）

1、準(zhǔn)備溶液

1）室溫融解試劑盒中的各種溶液，溶解后除結(jié)構(gòu)蛋白提取液外，其他試劑立即置于冰上；

2）結(jié)構(gòu)蛋白提取液溶解后，可放置于37℃水浴中溫浴至透明后，常溫放置。

2、蛋白提取工作液的準(zhǔn)備

1）胞漿蛋白提取工作液的準(zhǔn)備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實(shí)驗(yàn)時(shí)胞漿蛋白提取液的需要量，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

2）胞核蛋白提取工作液的準(zhǔn)備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實(shí)驗(yàn)時(shí)胞核蛋白提取液的需要量，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

3）膜蛋白提取工作液的準(zhǔn)備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實(shí)驗(yàn)時(shí)膜蛋白提取液的需要量，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

4）結(jié)構(gòu)蛋白提取工作液的制備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實(shí)驗(yàn)時(shí)結(jié)構(gòu)蛋白提取液的需要量，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF。

二、類器官收集及洗滌

1、類器官收集

移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)，輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組），4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化），300g ，4℃， 離心5min棄上清。

2、類器官清洗

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸，300g ，4℃，離心5min棄上清。

三、類器官蛋白提取

1、胞漿蛋白提取

1）向含類器官沉淀的EP中加入2mL的胞漿蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩20min；

2）準(zhǔn)備1-5mL的注射器，用注射器吹打步驟1震蕩過的溶液50-90次，在4℃條件下，15000g離心10min。取上清液存于EP管中，即為胞漿蛋白。

2、胞核蛋白的提取

取3.1.2步驟獲得的沉淀物加入4mL冰浴的胞漿蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min，棄去上清液，沉淀物中加入1mL冰凍的胞核蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min，上清液為細(xì)胞核蛋白，轉(zhuǎn)入EP管并保存。

3、胞膜蛋白的提取

在步驟3.2中的沉淀物中加入1mL冰凍的膜蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min，上清液為細(xì)胞膜蛋白，轉(zhuǎn)入EP管并保存。

4、結(jié)構(gòu)蛋白的提取

在步驟3.3的沉淀物中加入常溫或37℃水浴過的透明的結(jié)構(gòu)蛋白提取工作液0.5mL，4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min，保存上清液即為細(xì)胞骨架蛋白。

5、待測蛋白的保存待檢測濃度的蛋白存于-70℃，可以用于Western，EMSA，footprinting，報(bào)告基因檢測以及酶活力測定等后續(xù)操作。