6
LbCas12a (又名 Cpf1)核酸酶來源于 Lachnospiraceae bacterium ND2006 菌株。LbCas12a 是由 crRNA 介導(dǎo)的 DNA 核酸內(nèi)切酶，在靶標雙鏈 DNA 存在 PAM (TTN) 序列的情況下，特異地剪切靶標雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而 LbCas12a 特異地剪切單鏈 DNA 靶標不依賴 PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標均能激活 LbCas12a 的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當(dāng) LbCas12a酶與 crRNA、靶標 DNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會被激活針對非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。因此，LbCas12a 酶不僅可用于體外 dsDNA 的特異剪切，也可用于靶標核酸的快速檢測，詳見本公司開發(fā)的 HOLMES[1]核酸快檢技術(shù)。
產(chǎn)品組分
組分 | 32108-01(100 pmol) | 32108-03(1000 pmol) |
LbCas12a Nuclease (10 μM)a
| 100 pmol | 1000 pmol |
10 × HOLMES Buffer 1 | 1 mL | 1 mL |
Control Target DNA and crRNA b | 5 μL | 5 μL |
a. LbCas12a Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；
b. Control Target DNA and crRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個月內(nèi)使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系。
保存條件
Control Target DNA and crRNA 于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)剪切 1 pmol
ssDNA 探針所需的 Cas12a 酶量定義為 1 transU[2]。
例：若某批次 LbCas12a 酶的反式切割活性為 50.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 LbCas12a 酶可在 1 min 內(nèi)，在上述zhiding的反應(yīng)條件下，反式切割 50 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU 數(shù)值詳見各批號的 COA 檢測報告。
實驗流程
1、順式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM LbCas12a Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
10 μM crRNA | 0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNA c | 0.5 μL | 25 nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
l若用核酸電泳來分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用 dsDNA靶標，因為 ssDNA靶標會被反式激活的 Cas12a 進一步切碎。對于 20 μL 順式剪切應(yīng)體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長度 target DNA需要的 Cas 酶和 crRNA的量需要根據(jù) target DNA的摩爾量計算，建議保持 Cas 酶:crRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 targetDNA被剪切wanquan。
37℃反應(yīng) 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。
2. 反式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM LbCas12a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 250 nM |
10 μM crRNA | 0.05~0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNA d | 0.5~5 μL | 250 nM |
10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 250 nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪M行調(diào)整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，LbCas12a Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長期保存，請使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），crRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達平臺期的時間可參考各批號Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見本公司提供的 COA檢測報告！
實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，37℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號。
實驗結(jié)果
注意事項
1. 不同來源的 Cas12a 酶，其識別靶標所需的 PAM 位點也略有不同，其中大部分 Cas12a 酶可識別 TTN位點，而部分 Cas12a 則識別 TTTN 位點。
2. Cas12a 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12a 在 crRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標需帶有 PAM 位點，而 ssDNA 靶標不依賴 PAM 位點。
3. Cas12a 的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng) target DNA 存在時，Cas12a/crRNA 與 target DNA 形成三元復(fù)合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同時，Cas12a 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)體系中任意序列的單鏈 DNA
切碎。
4. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進行分子診斷實驗，可參考本公司的 HOLMES 體系[1]。
