AH109菌株來源于PI69-2A酵母菌株，將lacZ報告基因引入PI69-2A誕生了AH109此菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實驗用菌株，MATa型可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATa型酵母菌株 Y187通過mating操作進(jìn)行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為:trpl. leu2.報告基因為:lacZHIS3.ADE2MEL1 AH109-GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用: pGBKT7和pGADT7質(zhì)粒pGBKT7的篩選標(biāo)志為TRPL用于表達(dá)DNA-BD(來自酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4N端1~174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白;質(zhì)粒pGADT7的篩選標(biāo)志為LEU,用于表達(dá)AD(GAL4C端768~881位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Prev)的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理:一個完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結(jié)構(gòu)域:位于N端1~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域(DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)DNA-BD 能夠識別 GAL4- responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。而AD可以啟動UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下BD不與AD結(jié)合，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prev融合蛋白(prev-AD)，如果bait和prey發(fā)生相互作用，就會促使BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4.從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。AH109有四個報告基因:lacZ.HIS3

ADE2.MEL1分別由三種不同的啟動子(GAL.GAL2 MELL啟動這三種啟動子只有 GAL4 識別

的17bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。

操作方法:

1.取100ul冰上融化的AH109感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5ug,Carrier DNA(95

100℃5 min快速冰浴重復(fù)一次)10ulPEG/LiAc500ul 并吸打幾次混勻.30℃水浴 30mir(15min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

*備注:Carrier DNA 加入請?zhí)崆白冃蕴幚?95-100℃ 5min快速冰浴，重復(fù)一次。置于冰浴 5min之內(nèi)使用。

2.將管放42℃水浴15min(75min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3.5000rpm離心40s棄上清ddH400ul重懸離心30s棄上清。

4.ddH O50ul重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96h