本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗Rat VEGF 抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和shengwusu化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的Rat VEGF 與固相抗體和檢測抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)。洗滌后，加入顯色底物 TMB，避光顯色。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中Rat VEGF 的濃度成正比。加入終止液終止反應(yīng)，在 450 nm 波長(參考波長 570 - 630 nm)測定吸光度值。

1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清

300 × g 離心 10 分鐘去除沉淀物，即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。

2. 血清樣本

離心管收集血清。血樣凝集 30 分鐘后，1,000 × g 離心 10 分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。

3. 血漿樣本

EDTA、gouyuansuanna或肝素抗凝收集血漿樣本。1,000 × g 離心 30 分鐘收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清和血漿已經(jīng)過驗(yàn)證。

1) 能夠檢測 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀，參考波長 570 nm 或 630 nm

2) 移液器及槍頭、加樣槽

3) 準(zhǔn)備試劑用的試管、離心管、量筒等

4) 蒸餾水或去離子水

5) 渦旋振蕩器、微孔板振蕩器

檢測前請將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫（18℃-28℃）。如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37℃溫浴，直至結(jié)晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×濃縮洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水至 1,000 ml，輕輕混勻，避免泡沫。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。2 - 25℃貯存，1×洗液可穩(wěn)定保存 30 天。

1×檢測緩沖液

吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水至 50 ml，輕輕混勻，避免泡沫。2 - 8℃貯存，1×檢測緩沖液可穩(wěn)定保存 30 天。

試劑盒保存于 2 - 8℃，有效期標(biāo)注于標(biāo)簽上。

1) 重溶或者混合蛋白的時(shí)候，始終避免氣泡產(chǎn)生。

2) 避免交叉污染，在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品加樣、樣本加樣，以及不同試劑加樣的時(shí)候，請更換槍頭。不同的試劑，使用不同的加樣槽。

3) 在應(yīng)用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，加入洗液之后，設(shè)置 30 秒的浸泡程序，或者在不同的洗滌步驟將微孔板掉轉(zhuǎn) 180 度，這樣可以提高分析的準(zhǔn)確度。

4) 為保證結(jié)果的精確性，孵育時(shí)封好封板膜。

5) 顯色底物在添加之前應(yīng)是無色的。保持顯色底物始終處于避光態(tài)。

6) 終止液的添加順序應(yīng)與顯色底物的添加順序相同。

添加終止液之后，底物的顏色應(yīng)由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。如果底物呈現(xiàn)綠色，說明終止液與顯色底物沒有充分混勻。

7) 推薦所有的檢測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中設(shè)復(fù)孔。

8) 在任何情況下，避免接觸微孔板的內(nèi)表面。

檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫。
1) 準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。
2) 將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封好封口。
3) 浸泡酶標(biāo)板：加入 300μl 1×洗液靜置浸泡 30 秒。為了獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后，在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。
4) 加標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入 100μl 2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。空白孔加入 100μl 1×檢測緩沖液(血清/血漿樣本)或培養(yǎng)基
(細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本)。
5) 加樣本：血清/血漿：樣本孔加入 80μl 1×檢測緩沖液和 20μl 樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清：樣本孔加入 100μl 細(xì)胞培養(yǎng)上
清。保證步驟 4、5 連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在 15 分鐘內(nèi)完成。
6) 孵育：使用封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育 1.5 小時(shí)。
7) 洗滌：棄掉液體，每孔加入 300μl 洗液洗板，洗滌 6 次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)性能，必
須移除殘留液體。
8) 加檢測抗體：每孔加入 100μl 稀釋的檢測抗體(1:100 稀釋)。使用封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育 30 分鐘。
9) 洗滌：重復(fù)步驟 7。
10) 加酶孵育：每孔加入 100μl 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(1:100 稀釋)。使用新的封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分
鐘振蕩，室溫孵育 30 分鐘。
11) 洗滌：重復(fù)步驟 7。
12) 加信號增強(qiáng)劑孵育：每孔加入 100μl 稀釋的信號增強(qiáng)劑(1:100 稀釋)。使用新的封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫
精確孵育 15 分鐘。
13) 洗滌：重復(fù)步驟 7。
14) 再次加酶孵育：每孔加入 100μl 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(1:100 稀釋)。使用新的封板膜封板。300
轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫精確孵育 15 分鐘。
15) 洗滌：重復(fù)步驟 7。
16) 加底物顯色：每孔加入 100μl 顯色底物 TMB，避光，室溫孵育 5 - 30 分鐘。
17) 加終止液：每孔加入 100μl 終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕
叩擊板框，充分混勻。
18) 檢測讀數(shù)：在 30 分鐘之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定 450 nm zuida吸收波長和 570 nm 或 630 nm 參考波長
下的 OD 值。校準(zhǔn)后的 OD 值為 450 nm 的測定值減去 570 nm 或 630 nm 的測定值。僅使用 450 nm 測定會導(dǎo)致 OD
值偏高，并且準(zhǔn)確度降低。

1) 準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.99；

2) 靈敏度：zuidi檢測濃度小于50pg/mL；

3) 特異性：不與其他可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)；

4) 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%；

5) 貯藏：2-8°C，遊光防潮保存；

6) 有效期：6個(gè)月。