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設(shè)計(jì) LAMP 引物，請(qǐng)使用 NEB LAMP Primer Design Tool
·為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）提供便捷的一步法解決方案，可用于 DNA 或 RNA（RT-LAMP）樣品
·預(yù)混液含熱敏 UDG 和 dUTP，降低殘留污染風(fēng)險(xiǎn)
·預(yù)混液具備*緩沖力，可兼容不同樣品類型，適用于多種檢測方法
·溫啟動(dòng)技術(shù)可在室溫下抑制酶活性
·如需了解使用 RT-LAMP 進(jìn)行 快速篩查，請(qǐng)點(diǎn)擊 Learn more
產(chǎn)品描述
WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）為 LAMP/RT-LAMP 提供了便捷的一步法解決方案，適用于 DNA 或 RNA 樣品。LAMP 和 RT-LAMP 是一種常用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過使用 LAMP 特異性引物（用戶自備）和鏈置換 DNA 聚合酶進(jìn)行靶標(biāo)核酸的快速檢測。該預(yù)混液是在優(yōu)化后 LAMP 緩沖液中混入了 Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶和 WarmStart RTx 反轉(zhuǎn)錄酶。Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶和 WarmStart RTx 反轉(zhuǎn)錄酶均經(jīng)過基因工程改造，提高了在 LAMP 和 RT-LAMP 反應(yīng)中的性能。WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）具備*緩沖力，可兼容不同樣品類型，適用于多種檢測方法，包括：濁度檢測、實(shí)時(shí)熒光檢測（使用 LAMP 熒光染料時(shí)）和終點(diǎn)可視化檢測，例如：基于金屬離子指示劑的變色檢測（羥基萘酚藍(lán)）
由于先前擴(kuò)增的產(chǎn)物會(huì)無意中成為后續(xù)反應(yīng)的底物造成污染，因此預(yù)混液中的 dUTP 和熱敏 UDG 可有效降低殘留污染風(fēng)險(xiǎn)。熱敏 UDG 在溫度＞50℃時(shí)可*失活，因此對(duì)反應(yīng)沒有影響。
圖 1：WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）適用于多種檢測方法
使用 WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）（NEB #M1708）對(duì) RNA 或 DNA 樣品擴(kuò)增，可通過多種實(shí)時(shí)（A）和終點(diǎn)（B）檢測方法進(jìn)行結(jié)果判定。這些檢測方式包括熒光法、不基于 pH 的變色法（例如：羥基萘酚藍(lán)）、濁度法或瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)于實(shí)時(shí)熒光檢測，可使用包含 50X LAMP 熒光染料的試劑盒（NEB #E1708），在常規(guī)實(shí)時(shí) PCR 儀器的 SYBR®/FAM 通道中進(jìn)行監(jiān)測。
圖 2：LAMP/RT-LAMP 預(yù)混液和適用樣品類型
NEB 基于 pH 變化的 WarmStart 變色LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含/不含 UDG）（NEB #M1804）（NEB# M1800）緩沖力低，因此可使用 pH 敏感染料進(jìn)行可視化擴(kuò)增檢測?；?pH 值改變而產(chǎn)生的顏色變化（如粉紅變黃色）所需緩沖力要低，高緩沖力樣品或酸性樣品可能會(huì)影響顏色變化，因此，這種方法限制了檢測樣品的種類。WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含/不含 UDG）（NEB #M1708，NEB #E1708）（NEB #E1700）是*緩沖的，可檢測所有樣品類型，適用于多種檢測方法，包括熒光或其它變色染料（例如：羥基萘酚藍(lán)）
圖 3：WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）對(duì)人 DNA 和 RNA 靶標(biāo)進(jìn)行穩(wěn)健檢測
使用 WarmStart 熒光 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（不含 dUTP/UDG）（NEB #M1700 試劑盒中的組分）和 WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）（NEB #M1708）進(jìn)行 RT-LAMP（RNA 靶標(biāo)）或 LAMP（DNA 靶標(biāo)）實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)加入 1X LAMP 引物和 1X LAMP 熒光染料后，分別加入三個(gè)數(shù)量級(jí)的 Jurkat RNA 或 Jurkat DNA （10 ng-0.1 ng）和無模板對(duì)照（NTC），每個(gè)樣品做 4 個(gè)重復(fù)，形成 25 µl 反應(yīng)體系，置于 96 孔板中 65℃孵育 40 分鐘。使用實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀（Bio-Rad® CFX96）中的 SYBR/FAM 通道進(jìn)行 15 秒一次的熒光檢測。每個(gè)點(diǎn)代表熒光信號(hào)超過儀器閾值的時(shí)間。除了個(gè)別說明外，每個(gè)樣品都檢測到所有 4 個(gè)重復(fù)（注：如果各重復(fù)的檢測時(shí)間相似，則檢測點(diǎn)重疊）?？傮w而言，各樣品檢測結(jié)果顯示：NEB #M1700 和 NEB #M1708 性能一致。無模板對(duì)照均無擴(kuò)增。
圖 4：WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）對(duì)人 DNA 和 RNA 靶標(biāo)進(jìn)行穩(wěn)健檢測
通過手動(dòng)或 TEMPEST® 自動(dòng)化液體處理工作站（96 孔，25 µl 反應(yīng)）建立針對(duì)于合成 SARS-CoV-2 RNA 樣品的 LAMP 檢測體系。檢測樣品為：陽性樣品（人總 RNA 混入 5,000、500 或 50 拷貝的合成 SARS-CoV-2 RNA）或無模板對(duì)照（NTCs）。經(jīng) 65℃ 孵育 40 分鐘，使用 1X LAMP 熒光染料在實(shí)時(shí)熒光儀器（Bio-Rad CFX96）中的 SYBR/FAM 通道檢測。結(jié)果顯示：兩種體系的檢測時(shí)間和zuidi檢出限（LOD）結(jié)果一致。
圖 5：WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）兼容不基于 pH 的變色法（例如：羥基萘酚藍(lán)）
使用 WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 預(yù)混液（含 UDG）和針對(duì) N 和 E 基因的混合引物對(duì)合成 SARS-CoV-2 RNA 進(jìn)行擴(kuò)增，使用 0.12 mM 羥基萘酚藍(lán)作為變色金屬指示劑。檢測樣品為：陽性樣品（人總 RNA 混入 5,000、500 或 50 拷貝的合成 SARS-CoV-2 RNA）、陰性樣本（人總 RNA）或無模板對(duì)照（NTCs），如圖所示。反應(yīng)體系（25 µl）經(jīng) 65℃孵育 45 分鐘后，進(jìn)行肉眼檢測。
A.所有陽性樣品均顯示陽性結(jié)果，包括在所有僅含 50 拷貝的低起始量樣品（n = 20），顏色明顯從紫色變?yōu)樗{(lán)色。
B.所有陰性樣品均未出現(xiàn)顏色變化（n = 32）。
