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產品簡介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結構，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài)平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品為鬼筆環(huán)肽-iFluor 750標記探針會選擇性地結合F-肌動蛋白。以納摩爾濃度使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是方便的探針，用于標記，鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動蛋白，細胞培養(yǎng)物或無細胞實驗。肌動蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質，幾乎存在于所有真核細胞中。 它也是最高度保守的蛋白質之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過20％。 肌動蛋白是細胞中兩種細絲的單體亞基：微絲，細胞骨架的三個主要組分之一，以及微絲，是肌細胞中收縮裝置的一部分。 因此，肌動蛋白參與許多重要的細胞過程，包括肌肉收縮，細胞運動，細胞分裂和胞質分裂，囊泡和細胞器運動，細胞信號傳導，以及細胞連接和細胞形狀的建立和維持。

本品以1000×儲存液形式（溶于DMSO）提供，按照100µl/孔（96孔板），總共可做300T。

注意事項：   

鬼筆環(huán)肽  的分子量小，很容易通過細胞，不需要對細胞進行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

有幾種方法都能用來染色組織細胞培養(yǎng)物內的肌動蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細胞F-actin分布情況中至關重要。固定步驟基于實驗自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、實驗材料準備

1.1 iFluor 790Phalloidin（貨號LX5714）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（貨號 SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 （可選）抗熒光淬滅劑

1.6 （可選）即用型PI染色液（貨號 4209）

1.7 （可選）BSA, Standard Grade（貨號 J8660）

1.8 黑框/透明底的96孔細胞培養(yǎng)板

二、染色工作液準備

2.1 于實驗前將低溫保存的iFluor 790Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開瓶。

2.2 往瓶內加入30µl高質量無水DMSO，充分溶解，用槍吹勻，即得到1000×儲存液。按照單次用量進行分裝，置于-20℃避光保存，至少6個月穩(wěn)定。

2.3 開始實驗前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如1µl儲存液加入1ml PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測體系，按照100µl/孔來計算，準備足量的染色工作液；也可對細胞爬片進行染色，但需調整染色工作液的用量，以能覆蓋住細胞為準。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時間取決于特定的應用。根據特定的細胞類型和/或細胞/組織對探針的通透性來調整合適的染色條件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液現配現用，室溫避光保存。

三、染色流程（以96孔板為例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板進行細胞培養(yǎng)，使其貼壁生長達到70-80%的匯合度。

3.2 吸掉培養(yǎng)液，用37℃預熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細胞，室溫固定10-30min。【注意】：固定過程中甲醇能破壞肌動蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現配的iFluor 790Phalloidin染色工作液到每個孔內，室溫避光孵育30-90min。

【注意】：若有需要，此時可加入即用型DAPI染色液或其他不同于iFluor 790熒光光譜的細胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-GTM）到孔內保護熒光。

3.10 熒光顯微鏡下觀察染色結果，選擇iFluor 790激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=787/808nm）。若做細胞核染色，選擇合適濾片，比如DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

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