本品為鬼筆環(huán)肽-iFluor 405標(biāo)記探針會(huì)選擇性地結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白。以納摩爾濃度使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是方便的探針，用于標(biāo)記，鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)物或無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。肌動(dòng)蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有真核細(xì)胞中。 它也是最高度保守的蛋白質(zhì)之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過(guò)20％。 肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞中兩種細(xì)絲的單體亞基：微絲，細(xì)胞骨架的三個(gè)主要組分之一，以及微絲，是肌細(xì)胞中收縮裝置的一部分。 因此，肌動(dòng)蛋白參與許多重要的細(xì)胞過(guò)程，包括肌肉收縮，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂，囊泡和細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，以及細(xì)胞連接和細(xì)胞形狀的建立和維持。

Warbio生物以1000×儲(chǔ)存液形式（溶于DMSO）提供，按照100µl/孔（96孔板），總共可做300T。

注意事項(xiàng)：   

鬼筆環(huán)肽  的分子量小，很容易通過(guò)細(xì)胞，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

有幾種方法都能用來(lái)染色組織細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細(xì)胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實(shí)驗(yàn)自身需求來(lái)選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

操作步驟

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.1 iFluor 405 Phalloidin（貨號(hào) LX4801）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（貨號(hào) SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 （可選）抗熒光淬滅劑

1.6 （可選）即用型PI染色液（貨號(hào) 4209）

1.7 （可選）BSA, Standard Grade（貨號(hào) J8660）

1.8 黑框/透明底的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板

二、染色工作液準(zhǔn)備

2.1 于實(shí)驗(yàn)前將低溫保存的iFluor 405 Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開(kāi)瓶。第一次使用請(qǐng)將本品按照單次用量進(jìn)行分裝，置于-20℃避光保存，一年穩(wěn)定。

2.2 本品以1000×DMSO儲(chǔ)存液形式提供。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如1µl儲(chǔ)存液加入1ml PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測(cè)體系，按照100µl/孔來(lái)計(jì)算，準(zhǔn)備足量的染色工作液；也可對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行染色，但需調(diào)整染色工作液的用量，以能覆蓋住細(xì)胞為準(zhǔn)。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時(shí)間取決于特定的應(yīng)用。根據(jù)特定的細(xì)胞類型和/或細(xì)胞/組織對(duì)探針的通透性來(lái)調(diào)整合適的染色條件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲(chǔ)存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

三、染色流程（以96孔板為例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使其貼壁生長(zhǎng)達(dá)到70-80%的匯合度。

3.2 吸掉培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫固定10-30min?！咀⒁狻浚汗潭ㄟ^(guò)程中甲醇能破壞肌動(dòng)蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。的固定液是無(wú)甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細(xì)胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現(xiàn)配的iFluor 405 Phalloidin染色工作液到每個(gè)孔內(nèi)，室溫避光孵育30-90min。

【注意】：若有需要，此時(shí)可加入即用型PI染色液或其他不同于iFluor 405熒光光譜的細(xì)胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-GTM）到孔內(nèi)保護(hù)熒光。

3.10 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選擇iFluor 405激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=400/421nm）。若做細(xì)胞核染色，選擇合適濾片，比如PI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=536/617nm）。

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