CTC流式細(xì)胞術(shù)活細(xì)菌檢測(cè)試劑盒提供了一種簡(jiǎn)便的方法，可根據(jù)呼吸活動(dòng)評(píng)估細(xì)菌的健康和活力。CTC本身是非熒光的，一旦被活細(xì)菌細(xì)胞表面的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)還原，就會(huì)形成紅色和不溶性熒光CTC甲maz，可以用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到。不能呼吸的死細(xì)菌或以較低頻率呼吸的不健康細(xì)菌將不產(chǎn)生或帶有CTC染色的紅色熒光很少，因此可對(duì)細(xì)菌種群的健康狀況進(jìn)行半定量測(cè)量。

組件

1. 準(zhǔn)備10倍染料儲(chǔ)備液
2. 準(zhǔn)備細(xì)菌樣本
3. 將細(xì)菌樣品與CTC在37°C孵育30分鐘
4. PE-Texas Red通道通過流式細(xì)胞儀分析樣品

重要
在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每種試劑盒成分之一。

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. CTC儲(chǔ)備溶液（10倍）：
將1 mL蒸餾水加到CTC瓶（組分A）中，制成10倍儲(chǔ)備溶液。注意：原液在-20°C穩(wěn)定2周。避光。

程序

1. 制備濃度為10 ⁶細(xì)胞/ ml的細(xì)菌樣品。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中使細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)后期。通過以10,000 xg離心10分鐘除去培養(yǎng)基，然后將沉淀重懸于適量的PBS中。 注意： 在波長(zhǎng)= 600 nm（OD600）處測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，以確定細(xì)胞數(shù)。對(duì)于大腸桿菌培養(yǎng)，OD600 = 1.0等于8 x 10 ⁸細(xì)胞/ ml。
    
2. 根據(jù)需要用測(cè)試化合物處理細(xì)胞。通過以10,000 xg離心10分鐘來(lái)去除處理物，然后將沉淀物重新懸浮在適量的測(cè)定緩沖液（組分B）中，使處理后樣品中的細(xì)菌濃度與活菌濃度相同。 注意：開始治療之前，請(qǐng)確定細(xì)菌培養(yǎng)物的濃度。 注意： 死細(xì)菌可以作為陰性對(duì)照。建議用70％乙醇?xì)⑺兰?xì)菌30分鐘，然后煮沸60分鐘。
    
3. 將10 µL的10X CTC儲(chǔ)備溶液加到90 µL的細(xì)菌樣品中。
    
4. 充分混合，然后在黑暗中于37°C孵育30分鐘。
    
5. 在使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞之前，添加400 µL分析緩沖液（組分B）以增加體積。
    
6. 用流式細(xì)胞儀通過PE-Taxes Red通道（Ex / Em = 488/615 nm）監(jiān)測(cè)細(xì)菌的熒光。 注意：要排除雜物，建議將流式細(xì)胞儀的閾值設(shè)置為以下值：FSC> 10,000，SSC> 5,000。 注意： CTC的效率高度依賴菌株，因此會(huì)相應(yīng)優(yōu)化染色條件。

圖片

圖1.在37°C下，用1X CTC對(duì)活的和死的（經(jīng)乙醇處理和煮沸的）大腸桿菌染色30分鐘。通過具有488nm激發(fā)和615 / 24nm帶通濾光片的流式細(xì)胞儀分析樣品?；罴?xì)菌和死細(xì)菌種群顯示非常不同的峰值。