腺相關病毒(AAV)具有無致病性、高效的長期基因表達、易于基因操作以及免疫反應低(或在許多情況下缺乏)的特點，這一系列特性使其成為用于基因治療遞送的重要載體。然而，AAV制造過程復雜，限制因素多，已成為整個行業(yè)的瓶頸。

      由于存在圍繞貼壁培養(yǎng)放大的復雜性和勞動密集型問題，因此一些公司在策略上決定使用懸浮培養(yǎng)而不是貼壁培養(yǎng)來生產(chǎn)病毒載體。

由貼壁培養(yǎng)過渡到放大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)的過程需要適應細胞，這可能需要幾個月的時間，而且并不總是成功。這個過程可能會導致生產(chǎn)力下降、生長速度降低以及潛在的遺傳不穩(wěn)定，細胞基因表達模式的改變也很常見。在這種情況下，盡早使用懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)病毒載體的策略，有望大大簡化工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。

      值得注意的是，大規(guī)模生產(chǎn)工藝是保證高產(chǎn)量和可靠的AAV病毒載體商業(yè)化制造過程的關鍵，這依賴于穩(wěn)健的大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染過程。專業(yè)且富有實戰(zhàn)經(jīng)驗的轉(zhuǎn)染試劑供應商可以為高效穩(wěn)健的轉(zhuǎn)染過程提供重要支持，Polyplus-transfection是面向基因和細胞治療市場的GMP轉(zhuǎn)染試劑供應商，也是一家從最初的工藝開發(fā)到商業(yè)化向病毒制造商提供廣泛的技術和監(jiān)管支持的轉(zhuǎn)染試劑供應商。2018年，該公司推出了用于生產(chǎn)治療性病毒的GMP兼容轉(zhuǎn)染試劑（PEIpro-GMP）。

      近期，Polyplus-transfection公司推出了一款基于化學成分且不含動物源的陽離子納米技術的轉(zhuǎn)染試劑FectoVIR-AAV，專為懸浮細胞體系規(guī)?；a(chǎn)AAV而開發(fā)，可用在基因和細胞治療領域。

      FectoVIR-AAV適用于各種規(guī)格的搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、細胞培養(yǎng)袋和生物反應器中無血清懸浮培養(yǎng)的DNA轉(zhuǎn)染，且兼容在細胞培養(yǎng)過程中抗生素的使用。

      FectoVIR-AAV可以解決現(xiàn)有轉(zhuǎn)染試劑在AAV生產(chǎn)過程中的局限性，以下部分將展開描述現(xiàn)有挑戰(zhàn)，以及FectoVIR-AAV對比其他轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)勢。

高性能：懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中rAAV的高產(chǎn)量

      FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染試劑是一種新型的基于化學物質(zhì)的不含動物成分的轉(zhuǎn)染試劑，其設計目的是解決當前rAAV病毒載體產(chǎn)量和工業(yè)可擴展性方面的限制。

與PEIpro轉(zhuǎn)染試劑和其他競品相比，F(xiàn)ectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染試劑在懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)rAAV病毒載體方面表現(xiàn)出高性能。FectoVIR-AAV可重復性地大幅提高AAV的產(chǎn)量，與其他競品(PEImax)相比，增幅高達10倍(如下圖)。

▲ 與競品相比，F(xiàn)ectoVIR-AAV可提高病毒基因組的生產(chǎn)效率和包裝效率，從而使功能性rAAV-2-GFP的產(chǎn)量提高10倍。

      可擴展性：專為小規(guī)模到大規(guī)模生產(chǎn)而開發(fā)

可擴展性是保證高產(chǎn)量和可靠的rAAV病毒載體生產(chǎn)過程商業(yè)化的必要條件。大規(guī)模rAAV病毒載體的制造依賴于一個穩(wěn)健的大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染過程。大規(guī)模瞬態(tài)轉(zhuǎn)染意味著需要在給定的時間框架內(nèi)制備大量轉(zhuǎn)染復合物并將其添加到懸浮液細胞中，以便高效轉(zhuǎn)染。FectoVIR-AAV專門用于大規(guī)模轉(zhuǎn)染，可以解決AAV制造過程中體積和時間限制方面的局限性。

轉(zhuǎn)染復合物體積：

      通常，轉(zhuǎn)染復合體積占最終細胞培養(yǎng)體積的10％，這在擴大生產(chǎn)規(guī)模時可能會導致技術限制。FectoVIR-AAV經(jīng)過優(yōu)化，可將絡合量降低至1％，從而有助于制備用于大規(guī)模生產(chǎn)的轉(zhuǎn)染復合物。例如，對于200 L的細胞懸液體積，轉(zhuǎn)染復合體積可以從20 L (10％)降至2 L (1％)進行優(yōu)化。

▲ 優(yōu)化的FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染復合物制劑，可進行大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染孵育時間：

      大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染需要向懸浮細胞培養(yǎng)物中添加更大體積的轉(zhuǎn)染復合物，這意味著更長的轉(zhuǎn)移時間。使用FectoVIR-AAV，轉(zhuǎn)移時間不再是可以導致病毒滴度產(chǎn)量變化的限制因素。FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染復合物顯示出極大的穩(wěn)定性：將FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA混合后，可以在6h內(nèi)可靠地將轉(zhuǎn)染復合物添加到細胞中，而rAAV滴度產(chǎn)量沒有明顯變化。

▲ FectoVIR-AAV/ DNA復合物的長期穩(wěn)定性可確保工業(yè)規(guī)模的可靠滴定度。

靈活性：與各種商業(yè)培養(yǎng)基和細胞系統(tǒng)兼容

      合成細胞培養(yǎng)基的選擇特定于每個rAAV制造平臺。FectoVIR-AAV/DNA復合物的效率已在不同的市售合成復合介質(zhì)中進行了全面測試，并且效價收率在各種測試介質(zhì)中的變化很小。

▲ FectoVIR-AAV與幾種可用于懸浮HEK-293細胞的合 成培養(yǎng)基兼容。

      總的來說，與基因/細胞治療金標準領域的金標準PEIpro相比，F(xiàn)ectoVIR -AAV可獲得其2-3倍高感染滴度的病毒載體，且整個操作過程增加了更多的彈性。轉(zhuǎn)染時復合物的穩(wěn)定性可延長至6小時，復合物工作體積由10%減至1%，此外，DNA的用量也可減少25%，在減少成本的同時給大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染提供了諸多便利。GMP級用于臨床試驗的產(chǎn)品也已經(jīng)上市。

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