細(xì)胞分選常見問題

問題一

為什么建議磁珠分選而不是流式分選？

1)磁珠分選需要的設(shè)備簡(jiǎn)單，而流式分選需要配備分選型流式細(xì)胞儀，價(jià)格較為昂貴，而且流式分選對(duì)于操作員的技術(shù)要求很高，需要專門的培訓(xùn)并有一定的經(jīng)驗(yàn)后才能很好地完成流式分選；

2)磁珠分選所需要的時(shí)間遠(yuǎn)小于流式分選所需要的時(shí)間；

3)磁珠分選對(duì)于目的細(xì)胞的刺激比流式分選要小，流式分選過程中需要對(duì)目的細(xì)胞所在的液滴通電，并且需要經(jīng)過一個(gè)強(qiáng)電場(chǎng)的區(qū)域，對(duì)目的細(xì)胞的刺激相對(duì)較大；磁珠分選只是讓細(xì)胞處于一個(gè)低磁場(chǎng)中，基本可以忽略對(duì)細(xì)胞的影響，從保持細(xì)胞活力的方面考慮，磁珠分選要優(yōu)于流式分選。

因此，如果磁珠分選可以滿足實(shí)驗(yàn)需求時(shí)，應(yīng)盡量選擇磁珠分選的方法。

問題二

磁珠分選為什么要求細(xì)胞活性越高越好？

1)死細(xì)胞分泌DNA，DNA有粘性，會(huì)將磁珠標(biāo)記細(xì)胞和非標(biāo)記細(xì)胞粘在一起，如果是陽(yáng)選會(huì)影響純度，如果是陰選會(huì)影響得率。

2)細(xì)胞活性低時(shí)可能會(huì)影響抗原抗體的結(jié)合效率。

問題三

磁珠分選buffer是什么？

autoMACS running buffer（自己配制：pH7.2 PBS，0.5％BSA、2mM EDTA，如需無菌，建議購(gòu)買商品化buffer或紫外線照射，不建議高溫高壓滅菌）。

問題四

如果想分選的細(xì)胞有多個(gè)陽(yáng)性marker怎么辦？

可以選擇磁珠分選陰選+陽(yáng)選的方法，eg.分選小鼠脾臟naive CD4+T可以先用陰選的方法分到CD4+T細(xì)胞再用CD62L磁珠陽(yáng)性分選；也可以用磁珠+流式的方法。

問題五

分選柱可以二次使用嗎？

不建議，主要是分選柱內(nèi)填充的鐵珠在使用后易生銹。

問題六

 分選柱應(yīng)如何選擇？

不同的試劑盒對(duì)于MS/LS/LD柱的最大細(xì)胞上樣量和最大磁性細(xì)胞吸附量是不同的，建議一定要參考說明書；

此外，如分選的目的細(xì)胞較大（eg.巨核細(xì)胞或fibroblast），可考慮采用large cell colums。

磁珠分選- 方案A：MagniSort™陽(yáng)性分選

引言

下述方案是MagniSort™陽(yáng)性分選試劑盒的通用操作指南。具體請(qǐng)參見試劑盒內(nèi)的說明書。在陽(yáng)性分選中，待分選的細(xì)胞首先與標(biāo)記的抗體結(jié)合，然后被鏈酶親合素包被的磁珠捕獲。將細(xì)胞放入MagniSort™磁座后，陽(yáng)性細(xì)胞被磁場(chǎng)吸住，而陰性細(xì)胞仍游離在溶液中，可被棄掉。每個(gè)試劑盒中的化抗體和磁珠預(yù)先已滴定好最適濃度，為即用型試劑。

注意事項(xiàng)

注：MagniSort™ 5mL磁座可產(chǎn)生強(qiáng)磁場(chǎng)。應(yīng)遠(yuǎn)離心臟起搏器、、磁性身份卡、手表、計(jì)算機(jī)顯示器、硬盤等物品，以免損壞。

細(xì)胞制備

1. 在未特別說明的情況下，MagniSort™陽(yáng)性分選試劑盒已優(yōu)化，適用于小鼠二級(jí)淋巴組織或正常人PBMC。

2. 用于小鼠細(xì)胞時(shí)，建議用40μm的尼龍細(xì)胞篩清除碎屑，以使試劑盒發(fā)揮出最佳效果。

3. 正常人PBMC的制備，參見“細(xì)胞制備-方案D：從全血中提取PBMC"（第28頁(yè)）。為使MagniSort™試劑盒發(fā)揮最佳性能，建議洗滌白膜層，去除血小板。

4. 向緩沖液中加入EDTA減少細(xì)胞聚集。

后續(xù)用于無菌培養(yǎng)

1. MagniSort™陽(yáng)性分選抗體和陽(yáng)性分選磁珠中含有少量作為防腐劑。當(dāng)使用不含的無菌緩沖液時(shí)，它不會(huì)影響細(xì)胞功能。需要根據(jù)測(cè)試判斷在特定實(shí)驗(yàn)中的性能。

2. 分選無菌細(xì)胞時(shí)應(yīng)該在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，并使用帶蓋的聚苯乙烯無菌試管和無菌緩沖液。

提供的材料

? MagniSort™陽(yáng)性分選抗體，200次試驗(yàn)，20μL/次試驗(yàn)。2-8°C貯存。

? MagniSort™陽(yáng)性分選磁珠，4mL。2-8°C貯存。

所需其他材料

? 細(xì)胞分選推薦使用的緩沖液：添加3%胎牛血清（FBS）和10mM EDTA的PBS或Hank（HBSS）。2-8°C貯存。

? MagniSort™磁座，5mL。

? 12 x 75 mm流式管(5 mL，BD Falcon™，貨號(hào)352008或類似產(chǎn)品)。

? 15mL離心管(BD Falcon™，貨號(hào)352099或類似產(chǎn)品)

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 用適當(dāng)?shù)募?xì)胞分離液，制備濃度為1x107細(xì)胞/100μL（1 x 108/mL）的淋巴細(xì)胞懸液。

注：細(xì)胞必須制成單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)前需要檢查樣本，必要時(shí)用渦旋法或移液器去除細(xì)胞團(tuán)塊。

2. 將所需數(shù)量的細(xì)胞（不能超過2 x 108個(gè)細(xì)胞）放入12 x 75 mm的5mL試管中。

3. 每100μL細(xì)胞中加入20μLMagniSort™陽(yáng)性分選抗體。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。

4. 加入細(xì)胞分離液洗滌細(xì)胞，使其總體積達(dá)到4mL，在300xg下離心5分鐘。

5. 棄上清，然后用細(xì)胞分離液重懸細(xì)胞至最初的體積。

注：細(xì)胞必須制成單細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)前需要檢查樣本，必要時(shí)用渦旋或移液器去除細(xì)胞團(tuán)塊。

6. 每100μL細(xì)胞中加入20μLMagniSort™陽(yáng)性分選磁珠。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。

注：為確保最佳性能，將MagniSort™陽(yáng)性分選磁珠加入細(xì)胞之前必須充分混勻。將設(shè)定為1mL的Pipetman™ P1000移液器上下吹打5次，或者采用渦旋的方式重懸磁珠。7. 用細(xì)胞分離液將體積加至2.5mL。將設(shè)定為1mL的Pipetman™P1000移液器上下吹打3次，使其混勻。不能渦旋。

8. 將試管插入磁座中間的孔底，室溫孵育5分鐘。

9. 拿起磁座將試管內(nèi)的上清液倒入廢液容器內(nèi)；這些是不需要（未結(jié)合）的細(xì)胞。將試管倒置1秒鐘，然后回正。注：切勿吸干或搖晃倒置后的試管，否則會(huì)降低回收率。如果需要也可以收集起結(jié)合細(xì)胞。

10. 從磁座中取出試管并重復(fù)7-9步兩次，總共洗滌細(xì)胞3次。

11. 從磁座中取出含目標(biāo)細(xì)胞的試管，加入1mL細(xì)胞分離液。沿著試管側(cè)壁加入緩沖液，洗滌試管側(cè)壁。此時(shí)，試管內(nèi)就是分選的陽(yáng)性細(xì)胞，備用。

磁珠分選 -方案B：MagniSort™陰性分選

簡(jiǎn)介

以下是MagniSort™陰選試劑盒的通用操作指南，該試劑盒適用于細(xì)胞進(jìn)行陰性分選。具體請(qǐng)參見每個(gè)試劑盒內(nèi)的說明書。在陰性分選中，不需要的細(xì)胞與bition化抗體混合液結(jié)合，然后加入鏈霉親和素包被的磁珠。將細(xì)胞放入MagniSort™磁座后，不需要的細(xì)胞被磁場(chǎng)吸住，而需要的細(xì)胞游離在溶液中，將其倒出后即可使用。每個(gè)試劑盒中的ition化抗體和磁珠已預(yù)先滴定好最適濃度，為即用型試劑。

注意事項(xiàng)

注意：MagniSort™ 5mL磁座可產(chǎn)生強(qiáng)磁場(chǎng)。應(yīng)遠(yuǎn)離心臟起搏器磁性身份卡、手表、計(jì)算機(jī)顯示器、硬盤等物品，以免損壞。

細(xì)胞制備

1. 在未特別指明的情況下，MagniSort™ 陰選試劑盒已經(jīng)過優(yōu)化，專門適用于小鼠二級(jí)淋巴組織或正常人PBMC。

2. 用于小鼠細(xì)胞時(shí)，建議用40μm的尼龍細(xì)胞篩清除碎屑，以使試劑盒發(fā)揮出最佳效果。

3. 正常人PBMC的制備，參見“細(xì)胞制備-方案D：從全血中提取PBMC"（第28頁(yè)）。為使MagniSort™試劑盒發(fā)揮最佳性能，建議洗滌白膜層，去除血小板。

4. 緩沖液中加入EDTA減少細(xì)胞聚集。

后續(xù)用于無菌培養(yǎng)

1. MagniSort™陰選抗體混合液和陰性分選磁珠中含有少量作為防腐劑。當(dāng)使用不含的無菌緩沖液時(shí)，它不會(huì)影響細(xì)胞功能。需要根據(jù)測(cè)試判斷在特定實(shí)驗(yàn)中的性能。

2. 分選無菌細(xì)胞時(shí)應(yīng)該在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，并使用帶蓋的聚苯乙烯無菌試管和無菌緩沖液。

提供的材料

? MagniSort™陰選抗體混合液，200次實(shí)驗(yàn)，20μL/次試驗(yàn)。2-8°C貯存。

? MagniSort™陰性分選磁珠，4mL。2-8°C貯存。

所需其他材料

? 細(xì)胞分選推薦使用的緩沖液：PBS或添加3%FBS和10mM EDTA的HBSS。2-8°C貯存。

? MagniSort™磁座，5mL

? 12 x 75 mm流式管(5 mL, BD Falcon™, 貨號(hào)352008或類似產(chǎn)品)

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 用適當(dāng)?shù)募?xì)胞分離液，制備濃度為1x107細(xì)胞/100μL（1 x 108/mL）的單細(xì)胞懸液。

注：細(xì)胞必須制成單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)前需要檢查樣本，必要時(shí)用渦旋法或移液器去除細(xì)胞團(tuán)塊。

2. 將所需數(shù)量的細(xì)胞（不能超過2 x 108個(gè)細(xì)胞）放入12 x 75 mm的5mL試管中。

3. 每100μL細(xì)胞中加入20μLMagniSort™陰選抗體混合液。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。

4. 用細(xì)胞分離液洗滌細(xì)胞，使其總體積達(dá)到4mL，300xg離心5分鐘。

5. 棄上清，然后用細(xì)胞分離液重懸細(xì)胞至最初的體積。

注：細(xì)胞必須制成單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)前需要檢查樣本，必要時(shí)用渦旋法或移液器去除細(xì)胞團(tuán)塊。

6. 向每100μL細(xì)胞中加入20μL MagniSort™陰性分選磁珠。渦旋5次混勻。室溫孵育5分鐘。

注：為確保最佳性能，將MagniSort™陰性分選磁珠加入細(xì)胞之前必須充分混勻。將設(shè)定為1mL的Pipetman™ P1000移液器上下吹打5次，重懸磁珠，不能渦旋。

7. 用細(xì)胞分離液將體積加至2.5mL。將設(shè)定為1mL的Pipetman™P1000移液器上下吹打3次，使其混勻。不能渦旋。

8. 將試管插入磁座中間的孔底，室溫孵育5分鐘。

9. 拿起磁座以連續(xù)的動(dòng)作將試管內(nèi)的上清液倒入一支新的12x75 mm 5mL試管中并將磁座內(nèi)的試管倒置1秒鐘，然后回正。

注：切勿吸干或搖晃倒置后的試管，否則會(huì)降低未結(jié)合細(xì)胞的純度。

10. 將磁座中的試管丟棄。

11. 此時(shí)，新5mL 12 x 75 mm試管中的陰性細(xì)胞即為分選后的目的細(xì)胞，備用。

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