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南京億迅生物科技有限公司

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β-木糖苷酶(β- xylosidase)測定試劑盒

2019-12-24  閱讀(396)

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【詳細說明】

測定意義:

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細菌和真菌等生物體,是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guān)鍵酶,產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵。另外,β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應(yīng)用于造紙工業(yè),比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保,具有廣泛的應(yīng)用價值。

測定原理:

β-木糖苷酶催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對硝基苯酚,對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰,測定405nm光吸收增加速率,可計算β-木糖苷酶活性。

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體1mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:液體10mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體10mL×1瓶,4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

  1. 植物樣本:稱取約0.1g樣品,加1mL提取液充分冰浴勻漿,然后12000rpm,4℃,離心20min,棄沉淀 ,取20μL上清測定蛋白含量,剩余上清作為待測酶液。
  2. 細菌、真菌樣本:收集約500萬個細胞,加入1mL提取液,超聲波破碎(冰浴,功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000rpm,4℃,離心10min,棄沉淀 ,取20μL上清測定蛋白含量,剩余上清置于冰上待測。

測定操作表:

  1. 分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至405nm,對照管調(diào)零。
  2. 操作表

 

對照管

測定管

酶液(μL

40

40

試劑一(μL

 

10

試劑二(μL

80

70

混勻,45℃水浴20min

試劑三(μL

 80

80

混勻,靜置5min,對照管調(diào)零, 微量石英比色皿/96孔板,測定405nm吸光值,記為A405。

β-木糖苷酶活性計算公式:

  1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線:y=3.34x-0.001,R2=0.9991

1)按蛋白含量計算

酶活定義:45℃,pH7.4時,每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性(U/ mg prot=A405-0.001÷3.34÷T÷ε×d×稀釋倍數(shù)×1000 ÷Cpr

= 0.5424×(A405+0.001)÷Cpr

2)按樣本質(zhì)量計算:

酶活定義:45℃,pH7.4時,每克樣品1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性(U/g 鮮重)= A405-0.001÷3.34÷T÷ε×d×稀釋倍數(shù)×1000 ÷W

                           = 0.5424×(A405+0.001)÷W

3)按細胞數(shù)量計算:

酶活定義:45℃,pH7.4時,每104個細胞1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性(U/104 cell=A405-0.001÷3.34÷T÷ε×d×稀釋倍數(shù)×1000 ÷細胞數(shù)量

= 0.5424×(A405+0.001)÷細胞數(shù)量

ε:對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù),138mol/L/cm;d:比色皿光徑,1cm;T:反應(yīng)時間,20 min;稀釋倍數(shù):V反總÷V=5;10001000mL=1L;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y=1.67x-0.001,R2=0.9991

1)按蛋白含量計算

酶活定義:45℃,pH7.4時,每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性(U/ mg prot=A405-0.001÷1.67÷T÷ε×d×稀釋倍數(shù)×1000 ÷Cpr

= 2.1696×(A405+0.001)÷Cpr

2)按樣本質(zhì)量計算:

酶活定義:45℃,pH7.4時,每克樣品1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性(U/g 鮮重)= A405-0.001÷1.67÷T÷ε×d×稀釋倍數(shù)×1000 ÷W

                           = 2.1696×(A405+0.001)÷W

3)按細胞數(shù)量計算:

酶活定義:45℃,pH7.4時,每104個細胞1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性(U/104cell=A405-0.001÷1.67÷T÷ε×d×稀釋倍數(shù)×1000 ÷細胞數(shù)量

= 2.1696×(A405+0.001)÷細胞數(shù)量

ε:對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù),138mol/L/cm;d96孔板光徑,0.5cm;T:反應(yīng)時間,20 min稀釋倍數(shù):V反總÷V=5;10001000mL=1L;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

注意事項:

1、吸光度變化應(yīng)該控制在0.05~0.8之間。否則加大樣品量或稀釋樣品,注意計算公式中參與計算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測定,可選用考馬斯亮藍法蛋白含量測定試劑盒進行測定。

 



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