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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶

2019-11-19  閱讀(318)

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【詳細(xì)說明】

測(cè)定意義

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

測(cè)定原理

AGP催化的逆向反應(yīng)生成G1P,在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下測(cè)定NADPH增加速率,即可計(jì)算AGP活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制

提取液液體30mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體10mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1支,4保存;臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用;用不完的試劑仍4保存;

試劑三:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入2mL雙蒸水充分溶解備用;用不完的試劑仍4保存;

試劑四:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入3mL雙蒸水充分溶解備用;用不完的試劑仍4保存;

試劑五:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入3mL雙蒸水充分溶解備用;用不完的試劑仍-20保存;

試劑六:粉劑×1支,-20保存;臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用;用不完的試劑4保存;

試劑七:粉劑×1支,-20保存;臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用;用不完的試劑4保存;

粗酶液制備

稱取約0.1g組織加入1mL提取液,冰浴中勻漿。10000g ,4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

測(cè)定步驟(在1.5mL EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱μL

測(cè)定管

試劑一

100

試劑二

10

試劑三

50

試劑四

100

樣本

20

混勻,30保溫15 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴迅速冷卻

試劑五

100

試劑一

300

試劑六

10

試劑七

10

混勻后立即在340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1 2min后的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。

 

AGP活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。

AGP活性(U/mg prot)=反應(yīng)總體積(700μL ÷樣本體積(20μL ÷反應(yīng)時(shí)間(2min)÷NADPH消光系數(shù)(6.22×10-3×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度(mg/mL=2813×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度(mg/mL

此法需要自行測(cè)定粗酶液蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

AGP活性(U/g 鮮重=反應(yīng)總體積(700μL ÷樣本體積(20μL ÷反應(yīng)時(shí)間(2min)÷NADPH消光系數(shù)(6.22×10-3×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL) =2813×ΔA÷樣本鮮重(g/mL)

 



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