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南京億迅生物科技有限公司
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酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）活性測定試劑盒
2019-11-19 閱讀(293)
| 提 供 商 | 南京億迅生物科技有限公司 | 資料大小 | 29.5KB |
|---|---|---|---|
| 資料圖片 | 下載次數(shù) | 57次 | |
| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數(shù) | 293次 |
測定意義：
AAT是一個多功能蛋白大家族，主要負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種?；腿ヵ；磻?yīng)，在基因表達(dá)、代謝和信號傳導(dǎo)中具有重要作用。
測定原理：
AAT催化乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙?；蕉〈迹瑫r還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測定412nm吸光度增加速率，來計算AAT活性。
自備儀器和用品：
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體100 mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體25 mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1管，-20℃保存。臨用前加蒸餾水1mL充分溶解，4℃保存。
試劑四：液體2 mL×1管，4℃保存。
試劑五：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加入試劑二1mL充分溶解，4℃避光保存。
粗酶液提取：
稱取約0.1g樣品，加試劑一1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃離心20min，取上清液待測。
AAT測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調(diào)零；水浴鍋35℃預(yù)熱。
2. 對照管：依次在500μL EP管中依次加入140μL試劑二、10μL試劑三、20μL試劑四和10μL試劑五，20μL待測液，室溫放置10min后于412nm測定吸光度，記為A1。
3. 測定管：依次在500μL EP管中依次加入140μL試劑二、10μL試劑三、20μL試劑四和20μL待測液，35℃水浴15min，加10μL試劑五，室溫放置10min后于412nm測定吸光度，記為A2。△A測=A2-A1。
AAT活性計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
AAT活力單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U。
AAT (U/mg prot) = 1000×△A測×V總÷(Cpr×V樣) ÷T= 666.7×△A測÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
AAT活力單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U。
AAT (U/g 鮮重) = 1000×△A測×V總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T= 666.7×△A測÷W
Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，15min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
AAT活力單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.0005個單位為1U。
AAT (U/mg prot) = 2000×△A測×V總÷(Cpr×V樣) ÷T=1333.4×△A測÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
AAT活力單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.0005個單位為1U。
AAT (U/g 鮮重) = 2000×△A測×V總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T= 1333.4×△A測÷W
Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，15min。
注意事項：
上清液蛋白質(zhì)含量需要另外測定。建議購買本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
