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葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶試劑盒,微板法

葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 葉綠體 3-磷酸甘油醛脫氫酶(NADPH-GAPDH)試劑盒說明書 （貨號：WS8060W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 3-磷酸甘油醛脫氫酶分為胞質(zhì)型和質(zhì)體型，植物葉綠體中的 3-磷酸甘油醛脫氫酶 （EC 1.2.1.13）屬于是質(zhì)體型，多以 NADPH 為輔酶，催化糖酵解的逆反應(yīng)，將 1,3 二磷酸甘油酸還原為 3 磷酸甘油醛，該酶在同化 CO2 的卡爾文循環(huán)中起中心作用。 利用 GAPDH 逆向催化 1,3 二磷酸甘油酸和 NADPH 生成 3 磷酸甘油醛和 NADP，于 340nm 處測定 NADPH 的下降速率即可得出葉綠體中 NADPH-GAPDH 酶活性的高低。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液一 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×3 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，每支加 0.4mL 不完的試劑分裝后 蒸餾水溶解，用 -20℃保存，禁止 反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑三 液體μL×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 液體 16mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、天平、震蕩儀、低溫離心機(jī)、研缽。 四、葉綠體 3-磷酸甘油醛脫氫酶(NADPH-GAPDH)活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約0.2g樣本，加入1mL提取液一，快速冰浴勻漿后于4℃，1600rpm離心5min，棄沉 淀，取上清再4℃，5000rpm離心15min，棄上清留沉淀，向沉淀中加1mL提取液二，強(qiáng)力 渦旋震蕩15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃，13000rpm離心5min，取上清測定葉 綠體中3-磷酸甘油醛脫氫酶(NADPH-GAPDH)的酶活性。提示：整個(gè)葉綠體的提取過程須 保持4℃低溫環(huán)境。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 液體樣品：澄清的液體樣本直接檢測；若渾濁則離心后取上清液檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 340nm，設(shè)定溫度 25℃。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 10 試劑四 140 混勻，室溫（25℃）條件下，孵育 10min 試劑五 10 輕輕混勻，室溫（25℃）條件下，30s 時(shí)于 340nm 處讀取吸光值 A1，10min 后再讀取 A2， ΔA=A1-A2。 【注】1.若△A 的值在零附近，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間到 20min 后讀取 A2，改變后的反應(yīng)時(shí)間 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算?；蜻m當(dāng)加大樣本量(如 40μL，則試劑四相應(yīng)減少)，則改變后 的加樣體積需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若下降趨勢不穩(wěn)定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來參與 計(jì)算，相對應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對會 偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量，則改變后的加樣體積需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于 檢測； 4. 若ΔA 的值大于 0.5，則需減少反應(yīng)時(shí)間（如減少至 5min），或減少樣本量（如 10μL）， 則改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 和樣本量 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADPH-GAPDH（nmol/min/mg prot）=[ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=321.6×ΔA÷Cpr 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算 酶活定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADPH-GAPDH（nmol/min/g 鮮重）= [ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W ×V1÷V) ÷T=321.6×ΔA÷W 3、按照液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADPH-GAPDH(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=321.6×ΔA ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4L； T---反應(yīng)時(shí)間，10min； W---樣本質(zhì)量，g Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。