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胰蛋bai酶試劑盒-可見顯色法,微板法

胰蛋bai酶試劑盒-可見顯色法,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 胰*白酶（Trypsin）試劑盒說明書 (貨號(hào)：WS9021W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 胰蛋*酶(EC 3.4.4.4) 是蛋白酶的一種，可以催化水解酰胺鍵。是一種重要的消化酶。 胰*白酶催化水解 N-苯甲酰-DL-精*酸-對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽(BAPNA)生成對(duì)硝基苯胺，后者 在 405nm 有吸收峰，通過測(cè)定吸光值升高速率即可得出胰*白酶的活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存條件 備注 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 0.6mL×1 支 -20℃保存 若凝固則可于 37℃水浴至融化。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、天平、研缽、冰和蒸餾水。 四、胰*白酶活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn)樣本 和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 生理鹽水，進(jìn)行冰浴勻漿。4℃×12000rpm 離心 10min，取上清， 置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加 入 1mL 生理鹽水，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測(cè)，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min， 取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm。 ② 所有試劑解凍至 37℃或 37℃水浴 15-30min。 ③ 反應(yīng) mix 制備：試劑二若凝固則可于 37℃水浴至融化，再按照試劑一：試劑二=0.97mL： 0.03mL 混勻成反應(yīng) mix，現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少量配制多少反應(yīng) mix。 ④ 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 30 反應(yīng) mix 170 混勻， 立即于 405nm 處測(cè)定吸光值 A1，37℃ 條件下反應(yīng) 10min 后讀取 A2，ΔA=A2-A1。 【注】若ΔA 在零附近徘徊，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如延長(zhǎng)至 20min 后讀取 A2）或增加樣本量 V1 （如增至 50μL，則反應(yīng) mix 相應(yīng)減少），則改變后的 T 和樣本量 V1 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0259x - 0.001：x 為標(biāo)準(zhǔn)品(nmoL)，y 為ΔA。 2、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmoL 對(duì)硝基苯胺為一個(gè)酶活單位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(W×V1÷V)÷T=128.7×(ΔA+0.001)÷W 3、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmoL 對(duì)硝基苯胺為一個(gè)酶活單位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(V1×Cpr)÷T=128.7×(ΔA+0.001)÷Cpr 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmoL 對(duì)硝基苯胺為一個(gè)酶活單位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/104 cell)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(500×V1÷V)÷T=0.26×(ΔA+0.001) 5、按照液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1nmoL 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活單位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷V1÷T=128.7×(ΔA+0.001) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.03 mL； W---樣本質(zhì)量，g； 500--細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； T---反應(yīng)時(shí)間，10min； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底部，加入 0.1mL 乙 醇，渦旋震蕩溶解后再加入 0.9mL 的蒸餾水混勻，得到 10μmol/mL 備用。 2 用蒸餾水把母液稀釋成以下濃度：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際來調(diào)整濃度。 3 30μL 標(biāo)準(zhǔn)品+170μL 試劑一，混勻后于 405nm 處讀取 A 值，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。