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上海莼試生物技術(shù)有限公司
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鼠抗人b淀粉樣蛋白單克隆抗體技術(shù)原理
2022-6-14 閱讀(178)
鼠抗人b淀粉樣蛋白單克隆抗體技術(shù):
一、 原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針"是抗體，“顯色"用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝#纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
二、分類
現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用*種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
三、主要試劑鼠抗人單克隆抗體 BLA.36 、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)幔ㄒ岳谌芙怆p丙稀酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺g，加H2O至 00ml。）儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。
2、 十二烷基硫#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制，室溫保存。
3、 分離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到 BLA.36 4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調(diào)至pH6.8加水稀釋到00ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用 Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫#銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。0%（w/v）過硫#胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.
