根癌農(nóng)桿菌含有Ti 質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒上的T-DNA在Vir區(qū)（virulence region）基因產(chǎn)物的介導(dǎo)下可以插入到植物基因組中，誘導(dǎo)在宿主植物中瘤狀物的形成。因此，將外源目的基因插入到T-DNA 中，借助Ti質(zhì)粒的功能，使目的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主植物中并進(jìn)一步整合、表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)材料：

重組雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300 ，GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，擬南芥

實(shí)驗(yàn)試劑：

浸染液：1/2MS，1×B5維生素，5%蔗糖，50ml/L Silwet L-77， 0.044mM 6-芐氨基嘌呤（6-BA）(10ml/L of 1 mg/ml stock in DMSO) 。或使用只加入5%蔗糖和50-500ul/L Silwet L-77的水溶液作為浸染液。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 擬南芥的培養(yǎng)

將擬南芥種子經(jīng)10%雙氧水消毒后接種于MS培養(yǎng)基上，于22℃、光照10h培養(yǎng)1-2周，長出無菌苗后轉(zhuǎn)移至坧石和土（3：1）混合物上培養(yǎng)?！咀⒁猓簼穸纫笠恍?/span>

2. 成功轉(zhuǎn)化雙元載體的農(nóng)桿菌GV3101懸浮液（對(duì)數(shù)生長期）

將目的基因構(gòu)建到雙元載體上，之后，將重組的雙元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV1301并用卡那霉素（50mg/ml）篩選含有重組雙元載體的菌落。將農(nóng)桿菌接種在LB 液體培養(yǎng)基（含有慶大霉素25mg/L用于篩選Ti質(zhì)粒，卡那霉素50mg/L 用于篩選T-DNA）中，28℃，180r/min條件下震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，T-DNA 28℃，180r/min 在4℃和-20℃分別保存菌株備用。

3. 農(nóng)桿菌感染擬南芥

3.1 在轉(zhuǎn)化前三天，接種含有雙元載體的農(nóng)桿菌到5ml含有抗生素（慶大霉素20mg/L，卡那霉素50mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃下震蕩培養(yǎng)2天。

3.2 兩天后，將1ml培養(yǎng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到100ml含有抗生素的 LB液體培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)24h。（前面步驟由實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員準(zhǔn)備：保證每組有約80ml-100ml 的農(nóng)桿菌，事先分裝到兩個(gè)50ml的離心管中。）

3.3 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入離心管中，6000rpm/min，室溫條件下，離心10min，然后將上清倒出。

3.4 將沉淀用200ml浸染液重懸，形成均勻的農(nóng)桿菌懸浮液（OD600=0.8左右），并將農(nóng)桿菌懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)敞口的器皿中（500ml燒杯）。

3.5 選取初果期的健壯植株，帶盆缽一起倒扣于盛有農(nóng)桿菌懸浮液的容器上方，將整個(gè)花序浸入上述農(nóng)桿菌懸浮液中約20-30s，注意葉片盡量不與浸染液接觸。同一個(gè)燒杯中的農(nóng)桿菌懸浮液可以轉(zhuǎn)化10株或者更多株擬南芥。

3.6 將盆缽取下，橫放于暗箱中約24h。注意保持一定的濕度。

3.7 24h后將處理過的擬南芥植株放于22～25℃的光照條件下使其正常生長。

3.8 大約三周后收取成熟種子。

4. 注意事項(xiàng)

4.1 在箱底撒水保濕，然后將花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培養(yǎng)16-24h（過夜）后，將擬南芥放置于塑料培養(yǎng)池內(nèi)，并澆足Horgland營養(yǎng)液，恢復(fù)正常培養(yǎng)。

4.2 為了提高轉(zhuǎn)化率，去除塑料袋3天后，用吸管吸取適量重懸目的質(zhì)粒的新鮮轉(zhuǎn)化液，逐個(gè)醮沾花蕾。

4.3 轉(zhuǎn)化后擬南芥的培養(yǎng)恢復(fù)正常管理，一旦再出現(xiàn)側(cè)蘗或主苔出現(xiàn)分枝，及時(shí)剪除。

4.4 轉(zhuǎn)化5-6周后，為了加速擬南芥成熟可以適量少澆營養(yǎng)液。待擬南芥?zhèn)€別角果開始枯黃后，可將其角果剪下放于培養(yǎng)皿內(nèi)干燥。擬南芥角果大部分。

4.5 枯黃后，即可收取全部種子存于1.5ml 的EP管中（在蓋上扎一小孔以便干燥）。種子*干燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于-20℃冰箱內(nèi)長期保存。

產(chǎn)品信息：我司（上海懋康生物）提供一系列農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物研究用產(chǎn)品，從雙元載體（binary vectors），到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（competent cells），到常用植物培養(yǎng)基，到植物生長調(diào)節(jié)劑/誘導(dǎo)劑，到轉(zhuǎn)化篩選用的抗生素，所有產(chǎn)品現(xiàn)貨供應(yīng)，專為植物研究人員而設(shè)計(jì)。如果你需要更多關(guān)于產(chǎn)品或?qū)嶒?yàn)相關(guān)的問題，咨詢。

一、常用的植物雙元表達(dá)載體
貨號(hào)	名稱	規(guī)格	目錄價(jià)（元）	載體抗性	篩選標(biāo)記
MF3701-5UG	pCAMBIA1300 Vector	5μg	1200	卡那霉素Kan	潮霉素HygR
MF3702-5UG	pCAMBIA1301 Vector	5μg	1200	卡那霉素Kan	潮霉素HygR
MF3703-5UG	pCAMBIA1305.1 Vector	5μg	1500	卡那霉素Kan	潮霉素HygR
MF3704-5UG	pCAMBIA1305.2 Vector	5μg	1500	卡那霉素Kan	潮霉素HygR
MF3706-5UG	pCAMBIA2300 Vector	5μg	1200	卡那霉素Kan	新霉素Neo
MF3707-5UG	pCAMBIA2301 Vector	5μg	1200	卡那霉素Kan	新霉素Neo
MF3721-5UG	pBI121Vector	5μg	1500	卡那霉素Kan	新霉素Neo
MF3722-5UG	pBI121-EGFP Vector	5μg	1500	卡那霉素Kan	新霉素Neo
MF3724-5UG	pBI221 Vector	5μg	1450	氨芐青霉素Amp	/
MF3725-5UG	pBI221-EGFP Vector	5μg	1200	氨芐青霉素Amp	/
MF3731-5UG	pRI101-AN Vector	5μg	2000	卡那霉素Kan	遺傳霉素NPT II

二、常用的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
貨號(hào)	名稱	規(guī)格	目錄價(jià)（元）	農(nóng)桿菌類型
MF2301-1000UL	EHA101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	280	根癌農(nóng)桿菌
MF2301-5000UL	EHA101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1220	根癌農(nóng)桿菌
MF2302-1000UL	EHA105化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	280	根癌農(nóng)桿菌
MF2302-5000UL	EHA105化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1220	根癌農(nóng)桿菌
MF2303-1000UL	LBA4404化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	280	根癌農(nóng)桿菌
MF2303-5000UL	LBA4404化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1220	根癌農(nóng)桿菌
MF2304-1000UL	GV3101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	280	根癌農(nóng)桿菌
MF2304-5000UL	GV3101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1220	根癌農(nóng)桿菌
MF2305-1000UL	AGL1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	280	根癌農(nóng)桿菌
MF2305-5000UL	AGL1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1220	根癌農(nóng)桿菌
MF2306-1000UL	EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	600	根癌農(nóng)桿菌
MF2306-5000UL	EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	2400	根癌農(nóng)桿菌
MF2307-1000UL	EHA105電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	600	根癌農(nóng)桿菌
MF2307-5000UL	EHA105電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	2400	根癌農(nóng)桿菌
MF2308-1000UL	LBA4404電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	600	根癌農(nóng)桿菌
MF2308-5000UL	LBA4404電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	2400	根癌農(nóng)桿菌
MF2309-1000UL	GV3101電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	600	根癌農(nóng)桿菌
MF2309-5000UL	GV3101電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	2400	根癌農(nóng)桿菌
MF2310-1000UL	AGL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	600	根癌農(nóng)桿菌
MF2310-5000UL	AGL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	2400	根癌農(nóng)桿菌

三、常用的發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
貨號(hào)	名稱	規(guī)格	目錄價(jià)（元）	農(nóng)桿菌類型
MF2451-1000UL	MSU440化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	430	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2451-5000UL	MSU440化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1830	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2453-1000UL	C58C1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	430	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2453-5000UL	C58C1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1830	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2455-1000UL	K599化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	430	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2455-5000UL	K599化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1830	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2457-1000UL	Ar A4化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	430	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2457-5000UL	Ar A4化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1830	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2459-1000UL	Ar Qual化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	430	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2459-5000UL	Ar Qual化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1830	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2461-1000UL	Ar 1193化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	10×100μl	430	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2461-5000UL	Ar 1193化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	50×100μl	1830	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2452-0500UL	MSU440電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	10×50μl	720	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2452-2500UL	MSU440電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	50×50μl	3000	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2458-0500UL	Ar A4電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	10×50μl	720	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2458-2500UL	Ar A4電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	50×50μl	3000	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2460-0500UL	Ar 1193電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	10×50μl	720	發(fā)根農(nóng)桿菌
MF2460-2500UL	Ar 1193電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞	50×50μl	3000	發(fā)根農(nóng)桿菌

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農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法（農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞）

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