人體hTERT基因甲基化檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

人體hTERT基因甲基化檢測試劑是一種旨在通過化學方法使基因組中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，經(jīng)過甲基化特異性PCR擴增，探測到人體人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT啟動子CpG島甲基化信息的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的?？梢员挥糜?/span>人體人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT相關的表觀遺傳學研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，轉(zhuǎn)化保證。

技術背景

在基因的啟動子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復雙核苷酸“CG”的區(qū)域，稱為“CpG島”（CpG island）。在人類基因組內(nèi)，存在有近3萬個CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標志，而且還參與基因表達的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更是DNA甲基化的*位置。CpG島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達和表觀基因組學的主要課題。人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human omerase reverse transcriptase；hTERT），又稱hTRT、hTCS1 和hEST2，是端粒酶的核心結(jié)構(gòu)，即催化亞體（catalytic subunit）。hTERT的功能性表達是端粒酶獲得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶，使細胞獲得永生化。hTERT是端粒酶活性的限速決定成分，其mRNA表達水平與端粒酶活性之間具有密切的相關性。hTERT是一單拷貝基因，定位于5q15.33，屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族，具有進化上的保守性，序列總長約35kb，由16個外顯子和15個內(nèi)含子組成。端粒酶特異性T-motif和7個同源保守序列的RT-motif分別位于不同的外顯子上。hTERTmRNA 還有7種不同的剪切轉(zhuǎn)錄本，分為缺失型與插入型兩類。一旦突變或甲基化，會造成細胞繁殖調(diào)控機制缺失，而致腫瘤或細胞衰老等。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存 處理液（Reagent C）、 轉(zhuǎn)化液（Reagent D）、 助沉液（Reagent I）、 擴增液（Reagent M）、 補充液（Reagent N）、  U引物F（Reagent O）、  U引物R（Reagent P）、  M引物F（Reagent Q）和  M引物R（Reagent R）在－20℃冰箱里； 凈化液（Reagent F）和 針筒離心柱保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里； 處理液（Reagent C）和 轉(zhuǎn)化液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應物

微型臺式離心機：用于沉淀樣品或去除雜質(zhì)

渦旋震蕩儀：用于混勻反應物

真空泵：用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞：用于去除樣品中的液體成分

PCR儀：用于樣品擴增

PCR管或平板：用于PCR反應的容器

測序試劑盒：用于測序前的產(chǎn)物處理

實驗步驟

實驗開始前，將 處理液（Reagent C）和 轉(zhuǎn)化液（Reagent D）從－20℃冰箱中取出，置入室溫下。同時將其中一管 緩沖液（Reagent A）置入65℃恒溫水槽中預熱備用。然后進行下列操作：

• 轉(zhuǎn)化實驗

• 準備1個2.0毫升離心管
• 加入2微克DNA樣品
• 加入適量的 緩沖液（Reagent A）到50微升反應體系（注意：不要使用65℃預熱的 緩沖液（Reagent A））
• 加入xx微升 變性液（Reagent B），混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入xx微升 處理液（Reagent C）（注意：可見溶液呈現(xiàn)黃色）
• 在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒，充分混勻
• 加入xx微升 轉(zhuǎn)化液（Reagent D），上下傾倒混勻
• 加入xx微升 封隔液（Reagent E）
• 放進55℃恒溫水槽孵育16小時
• 小心抽去xx微升 封隔液（Reagent E）
• 加入xx毫升充分搖勻的 凈化液（Reagent F），上下傾倒混勻（注意： 凈化液（Reagent F）出現(xiàn)沉淀，37℃溫育后使用）
• 移入到針筒離心柱
• 連接到真空泵，將柱內(nèi)液體抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）
• 加入xx毫升 萃取液（Reagent G）
• 運用真空泵，將 萃取液（Reagent G）抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）
• 重復實驗步驟15至16一次
• 去掉針筒，將離心柱放在1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉殘余萃取液，更換新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升65℃預熱的 緩沖液（Reagent A）到離心柱
• 室溫下靜置1分鐘
• 放進微型臺式離心機離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉離心柱
• 加入xx微升 變性液（Reagent B）到離心管，混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入xx微升 濃縮液（Reagent H）
• 加入xx微升 助沉液（Reagent I）
• 加入xx微升 沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩30秒
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent K）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入xx微升 保存液（Reagent L）
• 放進－20℃冰箱保存

二、甲基化特異性PCR

• 將 擴增液（Reagent M）、 補充液（Reagent N）、  U引物F（Reagent O）、  U引物R（Reagent P）、  M引物F（Reagent Q）和  M引物R（Reagent R）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對一個樣本，準備2個PCR管，分別標記為U和M管
• 分別移出xx微升 擴增液（Reagent M）到PCR管里
• 分別加入1微升上述轉(zhuǎn)化實驗中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入xx微升  U引物F（Reagent O）和  U引物R（Reagent P）到U管中
• 分別加入xx微升  M引物F（Reagent Q）和  M引物R（Reagent R）到M管中
• 再分別加入xx微升 補充液（Reagent N）（反應總量為25微升）
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項9）
• 即刻進行熱啟動PCR反應：

• 反應完畢后，移取5微升進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳
• 陽性條帶：轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）――125 bp；轉(zhuǎn)化后甲基型（M）――115 bp

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 一個特定基因的甲基化特異性PCR通常包括：轉(zhuǎn)化后甲基型（M）、轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設計原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個CpG位點；CpG位點須在3端；PCR片段長度在80－250堿基
•   U引物F（Reagent O）、  U引物R（Reagent P）、  M引物F（Reagent Q）和  M引物R（Reagent R）的信息如下：

• 通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測PCR擴增后的結(jié)果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴增

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn)“U”和“M”同時呈現(xiàn)陽性；
• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 必要時，可以調(diào)整Tm溫度 
• 在－20℃冰箱里儲存的產(chǎn)品避免反復凍融
• 轉(zhuǎn)化后的DNA保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融
• 本公司同時提供系列基因甲基化分析試劑產(chǎn)品
• 本公司提供系列甲基化分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化保證
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應產(chǎn)量高