HL20023.7.1

通用型植物線粒體DNA萃取試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

通用型植物線粒體DNA萃取試劑是一種旨在通過物理或化學破膜及離心處理方法，從植物細胞或組織中分離出完整而純化的線粒體細胞器，然后進一步生物酶處理以獲得高質(zhì)量的線粒體DNA的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）、以及培養(yǎng)細胞的線粒體核酸成分的分離。用于后續(xù)的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產(chǎn)品即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，無核酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。 

技術(shù)背景

線粒體細胞器的研究是現(xiàn)代細胞生物學的zui重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細胞凋亡、能量代謝等研究的主要對象。線粒體DNA的分離和定量以及突變分析是研究中*的。 

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存凈化液（Reagent C）、去干擾液（Reagent G）、酶解液（Reagent H）、萃取液（Reagent I）和助沉液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于細胞或組織收集后離心或清洗

1.5毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺式離心機：用于沉淀細胞

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分

微型臺式離心機：用于沉淀核酸

尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)：用于去除植物裂解殘渣

小型漏斗：用于過濾的裝置

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

58℃恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

渦旋震蕩儀：用于混勻

實驗步驟

• 植物組織線粒體DNA分離（物理法）

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的5毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項7）
• （選擇步驟）準備1個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
• （選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過濾（注意：可以使用4層紗布替代）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管，放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質(zhì)體等殘渣
• 放入4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱保存或移出2微升進行PCR反應(yīng)

• 植物組織線粒體DNA分離（化學法）

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的5毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預(yù)冷的500微升強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入預(yù)冷的5毫升保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• （選擇步驟）準備一個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
• （選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過濾（注：可以使用4層紗布替代）
• 放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質(zhì)體等殘渣
• 放入4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱保存或移出2微升進行PCR反應(yīng)

• 植物細胞或原生質(zhì)體線粒體DNA分離（物理法）

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備5 X 10⁷植物細胞或原生質(zhì)體
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的5毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約80下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管，放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質(zhì)體等殘渣
• 放入4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱保存或移出2微升進行PCR反應(yīng)

• 植物細胞或原生質(zhì)體線粒體DNA分離（化學法）

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備5 X 10⁷植物細胞或原生質(zhì)體
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的5毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• （選擇步驟）超聲波處理1分鐘
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預(yù)冷的500微升強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入預(yù)冷的5毫升保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質(zhì)體等殘渣
• 放入4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱保存或移出2微升進行PCR反應(yīng)

注意事項

• 本產(chǎn)品為2 0次操作（1克植物組織或5 X 10⁷細胞）
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進行
• 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的組織或細胞量
• 建議植物組織使用組織勻漿器操作；德國的BRAUN細胞勻漿器zui為理想
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為80下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)。
• 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚類物質(zhì)的作用
• 不同組織，其線粒體含量不同；通常1克植物組織的線粒體含量為10至50微克線粒體蛋白
• 試劑中的溶液使用前搖勻；酶解液（Reagent H）需放進37℃凍溫育許；為避免反復(fù)凍融，建議適量分裝
• 通常1克植物組織或5 X 10⁷細胞中提取的線粒體DNA達1至10微克

13． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體DNA純度和產(chǎn)量zui為理想，確保無核DNA和外源性DNA污染

• 本公司提供系列植物線粒體分析技術(shù)產(chǎn)品 

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定萃取產(chǎn)量和純化程度高
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無基因組DNA污染